Трансформация плазмидная дрожжей

До 1983 г. все генно-инженерные эксперименты проводились на протопластах S. erevisiae. Однаш X. Ито с соавторами обнаружили, что плазмидн)оо трансформацию клеток дрожжей можно осуществить и без удаления клеточной стенки. Для этого клетки обрабатывают полиэтиленгликолем в присутствии катионов щелочных металлов (Li+, s+, Rb+, К+, Na+). Особенно хорошие результаты дает использование солей лития. Интересно отметить, что компетентность клеток дрожжей индуцирует в основном ПЭГ, а перечисленные катионы лишь повышают эффективность плазмидной трансформации. [c.293]

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. соИ, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую [c.150]

Реципрокная гомологичная рекомбинация между реплицирующимся плазмидным вектором и хромосомой дрожжей приводит к стабильной трансформации дрожжевых клеток. В приведенном примере вектор несет ген ТПР дикого типа (а также гены, необходимые для репликации). Гомологичная рекомбинация в мутантном локусе trp дрожжевой хромосомы ведет к появлению в хромосомной ДНК двух копий триптофанового гена, функционирующей и нефункционирующей. Образующие- [c.255]

ПЛАЗМИДНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ [c.292]

Препараты плазмидной ДНК, выделенные из дрожжей, можно использовать для рестрикционного анализа, а также для трансформации клеток Е. соИ с целью амплификации плазмиды. Эти процедуры описаны в табл. 7.8. [c.231]

Д. Армалео с соавторами в 1990 г показали, что плазмиды можно вводить в нативные клетки дрожжей при бомбардировке последних разогнанными до большой скорости (около 500 м/с) вольфрамовыми микрочастицами (диаметр 0,5-0,65 мкм), на которых адсорбированы молекулы плазмидной ДНК (так называемая генная пушка). Если адсорбировать на микрочастицах молекулы двух разных плазмид, данным методом удается осуществлять трансформацию дрожжей обеими плазмидами одновременно (котрансформацию) с частотой, близкой к 100%. [c.293]

С солевой методикой конкурирует метод электропорации клеток дрожжей. Эта процедура чрезвычайно проста и при правильном подборе условий обеспечивает примерно такой же уровень плазмидной трансформации, как и обработка клеток солями лития. Процедура электропорации выполняется в течение 10 мин, в то время как солевой метод занимает 2 ч, а метод протопластов — 3 ч. [c.293]

Выбор штамма-хозяина диктуется типом векторной плазмиды, которую предполагается использовать для трансформации хозяин должен нести мутацию в гене, копия которого б плазмиде выполняет роль селективного маркера. Так, если доминантным селективным маркером служит плазмидный ген сир1 (обеспечивающий устойчивость к ионам меди), перед исследователем открывается широкий выбор штаммов-хозяев (гаплоидных, диплоидных или даже не охарактеризованных пивных дрожжей), поскольку большинство из них чувствительно к ионам меди, а это единственное необходимое условие их пригодности для работы с данным вектором. [c.220]

Многочисленные эксперименты показали, что в зависимости от штамма S. erevisiae и типа векторной плазмиды оптимальные условия трансформации как протопластов, так и обработанных солевыми растворами клеток могут существенно различаться. В целом следует отметить, что наивысшего уровня плазмидной трансформации уцается достичь в системе протопластов дрожжей. Поэтому в тех случаях, когда необходимо получить представительную клонотеку гибридных плазмид и выявить в ней редко встречающиеся последовательности, предпочитают использовать протопласты. Эффективность плазмидной трансформации с помощью солевых методов на 1-2 порядка ниже, зато эти методы гораздо проще и дают высоковоспроизводимые результаты. Колонии трансформантов образуются на поверхности агаризованной среды, что позволяет осуществлять их перепечатку и т. п. Поэтому, когда не требуется максимальный уровень трансформации (например, при введении индивидуальной плазмиды, когда достаточно выделить несколько клонов), предпочитают проводить обработку клеток дрожжей растворами полиэтиленгаиколя и солей лития. [c.293]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология