Трансформация плазмидная

Рекомбинантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плазмидная ДНК из донорской клетки в реципиент-ную в естественных условиях. Некоторые плазмиды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и реципиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. Большинство плазмид, которые используются в работах с рекомбинантными ДНК, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в реципиентные клетки путем конъюгации. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происходит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами. Таким образом, введя в клетку, несущую мобилизуемый плазмидный вектор, плазмиду с конъюгативными функциями, можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. [c.77]

Разрезание плазмидной ДНК рестриктазой. Встраивание с помощью ДНК-лигазы в разрезанную плазмиду синтетического гена, кодирующего проинсулин (см. описание процедуры на рис. 25.1), Введение плазмидного вектора, содержащего синтетический ген, в Е. соИ (трансформация соН) [c.226]

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. соИ, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую [c.150]

Препараты плазмидной ДНК, выделенные из дрожжей, можно использовать для рестрикционного анализа, а также для трансформации клеток Е. соИ с целью амплификации плазмиды. Эти процедуры описаны в табл. 7.8. [c.231]

Как уже отмечалось, методы генетической инженерии в значительной степени основаны на использовании плазмидной трансформации и трансфекции (см. гл. 3). [c.123]

Хромосомную ДНК штаммов донора, таких, как штамм 1 (табл. 14.1), лучше всего выделять по методу Мармура ([29] разд. 22.2.1). Для получения активных в отношении трансформации препаратов ДНК последние этапы выделения, на которых удаляются остатки РНК, проводить не обязательно. ДНК плазмиды рУА13 можно выделить из штамма 1 и использовать для трансформации. Плазмидную ДНК выделяют методами, описанными в гл. 15. [c.77]

У ряда микроорганизмов с естественной компетентностью внутрь клетки проникает только однонитевая ДНК. Поэтому трансформация плазмидными ДНК, которые находятся в ковалентно-замкнутой суперскрученной форме, не осуществляется или осу- [c.183]

Для различных микроорганизмов, у которых описан процесс трансформации, разработаны свои методы получения компетентных клеток и их трансформации. В данном руководстве мы приводим методику приготовления компетентных клеток Е. соИ штамма С600 и их трансформации плазмидными ДНК с высокой эффективностью. [c.184]

У некоторых бактерий, в особенности грамположительных, существует процесс естественной трансформации (см. раздел 4 этой главы). Находясь в особом, ко.мпетентно.м, состоянии, эти бактерии способны получать ДНК, оказавшуюся в среде (напри.мер, ДНК из погибших клеток), в частности плазмидную ДНК. Это еще один путь перемещения плазмид из клетки в клетку. При трансформации грамположительных бактерий в клетку проникает лишь одна линейная цепь ДНК. Поэтому для восстановления кольцевого плаз- [c.111]

Если искомый ген кодирует продукт, без которого мутантная клетка-хозяин не может расти на минимальной среде, то библиотеку можно создать методом трансформации мутантных клеток. Клетки, выросшие в отсутствие необходимого субстрата на минимальной среде, обязательно содержат функциональный искомый ген, попавший в клетку в составе плазмидного вектора. В разных вариантах этот подход использовали для выделения многих важных генов, в частности генов, ответственных за синтез антибиотиков и образование азотфиксируюших клубеньков на корнях некоторых растений. [c.70]

Трансформация — это процесс введения свободной ДНК в бактериальную клетку. Е. соИ используется в качестве организма-хозяина при работе со многими рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором СаСЦ, а затем вьщерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Этот метод дает максимальную частоту трансформации, примерно 10 , т. е. на каждую 1000 клеток приходится одна трансформированная. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, составляет примерно 10 —10. Частота трансформации никогда не бывает 100-процентной, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать трансформированные клетки. [c.76]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отнощении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х . Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации Е. соИ, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Х , получили функциональный интерлейкин-2. [c.126]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10-30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза -задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержагцего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т. е. ген, восстанавливающий (комгглементиру-ющий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров. [c.259]

С ПОМОЩЬЮ этого метода были транспортированы гены в хлоропласты и митохондрии. На поверхность микрочастиц можно осадить плазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это позволяет повысить частоту трансформации гтутем увеличения количества плазмидной ДНК однако следует иметь в виду, что слишком большие ее количества могут оказаться губительными для клетки. [c.381]

Рис. 18.11. Плазмидный вектор, содержащий кластер генов хитиназы риса и кластер генов устойчивости к гигромицину, использовавщийся для трансформации протопластов риса. Трансформацию осуществляли обработкой протопластов полиэтиленгликолем в присутствии плазмидного вектора. Затем отбирали клетки, устойчивые к гигромицину, и проводили тестирование клеток на наличие генов хитиназы с помощью гибридизации по Саузер-ну и на наличие самой хитиназы методом Вестерн-блоттинга. Далее из клеток регенерировали целые растения.

С разработкой Т1-плазмидной системы трансформации растений у исследователей появилась возможность введения в них чужеродных генов с целью синтеза различных ценных белковых продуктов. Вначале большинство генов, вводимых в растительные ютетки, находились под транскрипционным контролем сильного конститутивного 358-промотора вируса мозаики цветной капусты или немного менее сильного конститутивного промотора гена нопалинсинтазы, содержащегося в некоторьгх Т-ДНК. Однако для получения растений с новыми полезными признаками часто бывает необходимо, чтобы специфические белки синтезировались только в определенной тка- [c.403]

Метод репликации функциональной ДНК, включающий трансформацию в подходящих условиях соответствующих одноклеточных организмов с помощью функциональной ДНК с целью получения трансформантов, при этом функциональная ДНК получена in vitro следующим образом а) расщеплением вирусной или кольцевой плазмидной ДНК, совместимой с указанным одноклеточным организмом, с получением линеаризованного фрагмента, содержащего интактный репликон и концевой участок с заранее заданными свойствами б) объединением первого линеаризованного фрагмента со вторым, чужеродным по отношению к указанному одноклеточному организму и содержащим по меньщей мере один интактный ген и концевой участок, способный к лигированию с концевым участком первого линеаризованного фрагмента, причем по меньшей мере один из линеаризованных фрагментов содержит ген определенного фенотипического признака в условиях, подходящих для такого объединения, причем концевые участки первого и второго фрагментов объединяются с образованием функциональной ДНК, способной к репликации и транскрипции в указанном одноклеточном организме выращивание указанного одноклеточного организма в подходящей питательной среде и выделение трансформантов, обладающих данным фенотипическим признаком, проявление которого обусловливается У указанной функциональной ДНК. [c.540]

Рис. 149. Схема получения клеток Rhizobium теШо11, несущих дополнительные гены азотфиксации 1 — плазмидная ДНК, 2 — рестриктаза, 3 — клетка Rh.meliloti, 4 — хромосома клетки, 5 — nif-гены, 6 — лигаза, 7 — рестриктирован-ная плазмидная ДНК, 8 — плазмидная ДНК с nif-геном, 9 — трансформация, 10

Плазмидная ДНК прочно интегрируется в хромосомную ДНК растительных клеток и вызывает их опухолевый рост. Путем прививки таких клеток можно передать опухоль здоровому растению таким образом, после того как клетки претерпели опухолевую трансформацию, бактерия и ее плазмида становятся уже ненужными. Интегрированная ДНК плазмиды ответственна также за способность клеток вырабатывать новые ферменты, с помощью которых синтезируются аминокислоты октопин и нопалин, так называемые опины. Эти аминокислоты могут использоваться бактерией А. tumefa iens в качестве источника углерода и азота. Благодаря Ti-плазмиде Agroba terium получает, таким образом, преимущественный доступ к продуктам фотосинтеза растения Ti-плазмида обеспечивает образование аминокислот, которые могут быть усвоены только этой бактерией. [c.152]

При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержашую культуру Е. соИ. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране Е. соИ быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией. [c.223]

Важным этапом работы по генетической трансформации растений является выделение и клонирование генов, создание на их основе векторов для переноса чужеродных генов из клеток-доноров в клетки-раципиенты. Использование плазмидных, транспозонных, вирусных, пневмобалли-стических и других векторных систем позволяет исследователям осуществлять трансформацию растительных генотипов и получать трансгенные (модифицированные) растения с заданными или близкими к ним свойствами и качественными характеристиками. [c.422]

Мандель и Хига [28] обнаружили, что обработка клеток Е. oli СаСЬ с последующими инкубацией на холоду и тепловым шоком приводит к включению ДНК, добавленной в среду. Их результаты дали толчок к разработке ряда приемов, позволяющих индуцировать состояние компетентности у бактерий различных родов и тем самым осуществлять трансформацию хромосомной и плазмидной ДНК, а также реализовать возможность трансфекции с помощью ДНК бактериофагов. [c.75]

При получении ДНК этим методом выход составляет 75—80% для плазмидной ДНК с мол. массой 7,4- 10 —60-10 и для фрагментов, полученных под действием рестриктазы Есо RI с размерами от 0,75-10 до 13,9-10 . ДНК, экстрагируемая с помош,ью агаразы, вызывает трансформацию фактически с той же частотой (для клеток Е. oli), что и ДНК, не контактировавшая с этим ферментом. Извлеченные из гелей фрагменты ДНК с успехом использовались в экспериментах по клонированию в качестве источника или носителя генетической информации [11]. [c.145]

Выбор штамма-хозяина диктуется типом векторной плазмиды, которую предполагается использовать для трансформации хозяин должен нести мутацию в гене, копия которого б плазмиде выполняет роль селективного маркера. Так, если доминантным селективным маркером служит плазмидный ген сир1 (обеспечивающий устойчивость к ионам меди), перед исследователем открывается широкий выбор штаммов-хозяев (гаплоидных, диплоидных или даже не охарактеризованных пивных дрожжей), поскольку большинство из них чувствительно к ионам меди, а это единственное необходимое условие их пригодности для работы с данным вектором. [c.220]

Добиться репзгикагщи и амплификации в составе плазмидной (или фаговой) ДНК после трансформации (или соответственно трансфекггии) бактериальной клетки еще не значит регнить все проблемы. Прежде всего возникают два вопроса [c.124]

Все рассмотренные выше методы селекции продуцентов биологически активных веществ сегодня, в период интенсивного развития методов генной инженерии, называют традиционными методами. Эти методы в прошедшие 30 лет в огромной мере содействовали созданию микробиологической промышленности антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов и других практически важных веществ. Исчерпали ли традиционные методы свои возможности Нам кажется, думать так преждевременно, как и надеяться на то, что генная инженерия в ближайшее время сможет быть применена для создания и улучшения обширного круга принадлежащих к разным таксономическим группам продуцентов, которыми располагает сейчас микробиологическая промышленность. Даже более реальная возможность использовать иа основе генноинженерных методов в качестве продуцентов микроорганизмы, для которых эти методы наиболее отработаны, например E sheri hia oli, едва ли удовлетворит промышленность числом продуктов микробного синтеза. В связи с этим очень важно для старых перспективных в промышленном отношении микроорганизмов, помимо совершенствования методов отбора нужного типа мутантов, развивать методы генетического обмена на основе слияния протопластов, трансдукции, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК, которые расширяют возможности традиционных методов селекции. Вместе с тем у промышленных микроорганизмов все шире проводится поиск плазмид и предпринимаются попытки их использования в качестве векторов при переносе генетического материала, его клонировании и амплификации. Эти исследования важны для понимания генетического контроля сложных процессов синтеза, таких, иапример, как синтез антибиотиков, для выявления узких мест в биосинтезе многих других продуктов. Одновременно они приближают промышленные микроорганизмы к объектам генной инженерии. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется и расширяет свои возможности. В таком успешном встречном развитии разных методов и их слиянии на все большем числе продуцентов можно представить себе ближайшее будущее селекции микроорганизмов, призванной обеспечить промышленность высокопродуктивными штаммами. [c.95]

Трансформация — это процесс переноса генетической информации. при котором ДНК. выделенная из клетки-донора, поступает в клетку-реципиент. Реиипиентная клетка, в которой происходит экспрессия генетического материала донора, называется трансформантом. Трансформация может осуществляться как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Процесс, при котором выделенная ДНК фагов поступает в бактериальные клетки и обусловливает образование в них зрелых фаговых частиц, называется трансфекцией. [c.115]

Применение методов молекулярного клонирования к актино-мицетам оказалось возможным благодаря разработке эффективных способов получения и регенерации протопластов, трансформации протопластов плазмидной ДНК и трансфекции фаговой ДНК, конструированию векторных молекул на основе плазмид и фагов. [c.166]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология