Концентрация антител и глюкозооксидазы

Концентрация антител и глюкозооксидазы [c.137]

Скорость формирования окраски на индикаторной полоске зависит от содержания иммобилизованных антител и глюкозооксидазы, а его можно регулировать, изменяя концентрации белков при иммобилизаций. Для изучения влияния концентрации антител на интенсивность окраски мы получили индикаторные полоски с различным содержанием антител против морфия при одинаковой активности глюкозооксидазы (4 мМЕ/см ) и использовали эти полоски для анализа отрицательных образцов мочи (рис. 10-3). С увеличением концентрации антител интенсивность [c.137]

Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с е-аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой, глюкоамилазой. Состав полученных конъюгатов можно варьировать, изменяя концентрацию альдегида и белковых компонентов. [c.109]

Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— [c.111]

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и р- )-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА. [c.64]

Ферментативный иммунохроматографический метод. Добавляют 10—20 мкг образца (буферного раствора, сыворотки или цельной крови) к 1 мл ферментного реагента (приготовленного на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 и содержащего 0,2 моль хлорида натрия 0,2—1,0 мг конъюгата [теофиллин — пероксидаза] 100 мг глюкозооксидазы 2 г неиммунных IgG барана). В полученную смесь погружают край индикаторной полоски (4x90 мм), содержащей иммобилизованные антитела против теофиллина ( 30 мкг/см ),и дают растворителю подняться за счет капиллярных сил до противоположного края полоски (на это уходит 10 мин). Переносят полоску в проявитель (приготовленный на 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, и содержащий в 1 л 0,02 моль хлорида натрия 0,5 г тритона QS-44 400 мг 4-хлорнафтола 0,05 моль глюкозы 2 г бычьего сывороточного альбумина). Через 5 мин на бумаге появляется голубая окрашенная область в форме ровной полосы или ракеты. Высота окрашенной области пропорциональна концентрации определяемого вещества. Для количественного анализа предварительно строят калибровочную кривую, отражающую зависимость высоты окрашенного фронта от концентрации теофиллина. [c.135]

Как показано на рис. 10-2, активную поверхность индикаторной полоски образуют антитела против морфия, иммобилизованные совместное глюкозооксидазой на подложке из целлюлозы. На первой стадии анализа полоску погружают в жидкий образец. Центры связывания на антителах заполняются молекулами антигена, причем степень заполнения пропорциональна его концентрации. Затем полоску переносят в проявляющий раствор, содержащий конъюгат [пероксидаза—морфий], глюкозу и хромогенный субстрат пероксидазы (4-хлорнафтол).При инкубации с проявителем конъюгат связывается с вакантными центрами на иммобилизованных антителах и катализирует окисление 4-хлорнафтола пероксидом водорода, генерируемым иммобилизованной глюкозооксидазой, с образованием нерастворимого голубого продукта, который остается на поверхности полоски. Через 10 мин визуально или с помощью отражательного спектрофотометра определяют интенсивность окраски. [c.136]

Рис. 10-3. Зависимость интенсивности окраски от концентрации иммобилизованных антител и глюкозооксидазы. Индикаторные полоски с различным содержанием антител на основндм графике) или глюкозооксидазы (на врезке) использовали для анализа отрицательных образцов мочи, как описано в разд. Материалы и методы . Публикуется с разрешения издательства (Litman et al., 1983).

Справочник химика 21

Химия и химическая технология