Глюкозооксидаза определение активности

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ [c.20]

Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление Р- )-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты. Вторым продуктом реакции является пероксид водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах, эквимолярных окисленной глюкозе. Пероксид Водорода под влиянием фермента пероксидазы окисляет гек-сацианоферроат калия, который переходит в гексацианоферриат калия, окрашенный в лимонно-желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству глюкозы. Порядок определения активности и всех связанных с этим работ следующий. [c.287]

Рис. 7-3. Зависимость регенерируемой активности глюкозооксидазы от концентрации ДНФ—АпоГО. К 10 мл раствора с разным содержанием ДНФ—АпоГО, выраженным через концентрацию FAD-связывающих участков, прибавляли 10 мкл 1 мкМ FAD (насыщающая концентрация, см. рис. 7-2) и инкубировали 15 мин при 25 С Затем добавляли 4 мл смеси для определения активности (состав см. в подписи к рис. 7-2), инкубировали 15 мин при 25 °С и измеряли поглощение при 590 нм.

Недавно для определения активности фермента был предложен экспресс-метод [74], позволяющий непрерывно регистрировать образование глюкозы непосредственно в спектрофотометрической кювете. При избытке глюкозооксидазы и пероксидазы в системе лимитирующей стадией сопряженной реакции является гидролиз целлобиозы и скорость образования окраски прямо пропорциональна скорости образования целлобиозы. Определение активности проводится в рН-оптимуме целлобиазы (pH 4,5-5,0), занимает 2-10 мин Метод позволяет в 10-20 раз повысить чувствительность определения целлобиазной активности. Недостатком данного способа является, прежде всего, нестабильность реагента при хранении даже в течение дня. [c.140]

Специфичность действия ферментов — наиболее важное его свойство. Большинство ферментов активны только в реакциях с субстратом строго определенной структуры или с группой субстратов, имеющих общие структурные группы. Например, фермент глюкозооксидаза окисляет только глюкозу, поэтому ферментативное определение глюкозы можно проводить без разделения сложной смеси моно- и олигосахаридов, что, естественно, упрощает выполнение анализа. [c.83]

Фотометрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием о-фенилендиамина. [c.73]

Лленадо и Речниц изучали функционирование автоматизированных систем, в которых возможно быстрое определение активности энзима [731. Полезность создания непрерывных автоматических проточных систем, в которых использовались электроды, селективные к ионам цианида [см. уравнения (XI.28) и (XI.23) ] и иодида [см. уравнение (XI.7)], продемонстрирована на примере определения активности р-глюкозидазы, роданезы и глюкозооксидазы. [c.346]

Рис. 7-2. Восстановление активной глюкозооксидазы из ДНФ—АпоГО и FAD. Растворы (10 мкл), приготовленные на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 6,5, и содержащие FAD в разных концентрациях (25— 500 нМ), смешивали с 10 мкл раствора ДНФ—АпоГО и инкубировали 30 мин при 25 С. К каждому из полученных растворов добавляли смесь для определения активности (4 мл), инкубировали при 25 °С еще 5 мин и измеряли поглощение при 590 нм. Смесь для определения активности, приготовленная на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 6,5, содержала 75 мМ D-глюкозу, 3 мМ ДМАБК,

На первой стадии глюкоза окисляется растворенным кислородом до -глюконолактона с образованием стехиометрического количества перекиси водорода, которая на второй стадии количественно окисляет о-дианизидин Существует большое количество модификаций метода с фотометрическим определением начальной скорости реакции на второй стадии или по конечной точке реакции, с использованием других субстратов пероксидазы — ферроцианида и других. В ряде модификаций вторая стадия проводится неферментативным способом. Помимо фотометрического широко используется также потенциометрический и амперометрический методы определения глюкозы с помощью глюкозоокси-дазы. Наиболее традиционным является применение кислородного электрода Кларка в сочетании с глюкозооксидазной мембраной. Совместная иммобилизация в мембране глюкозооксидазы и /3-глюкозидазы позволяют определять с помощью ферментного электрода активность целлюлазного комплекса Однако чувствительность ферментных электродов, как правило, ниже, чем у фотометрического метода с использованием глюкозооксидазы. [c.133]

Характерной особенностью ферментов является специфичность их действия. Каждый фермент действует на строго определенный субстрат. Специфичность бывает абсолютная, когда фермент действует на один субстрат (уреаза), групповая— когда фермент действует на ряд соединений с определенными атомными группировками (липаза), а также стереохими-ческая — когда фермент действует на определенные стереоизомеры (р-глюкозооксидаза). Активность ферментов в клетке строго регулируется. Процесс биосинтеза ферментов находится под генетическим контролем. Активность ферментов регулируется концентрацией конечных и промежуточных продуктов превращения субстрата, а также условиями окружающей среды. [c.82]

Кордонье и др. [520] описали биферментные электроды для определения лактозы, мальтозы и сахарозы. В этих электродах кроме соответственно р-галактозидазы, мальтазы и инвертазы используется и глюкозооксидаза. Предложенный прибор представляет собой кислородный электрод Кларка с цилиндрическим магнитом, на котором фиксируется магнитная пленка, несущая биферментную систему. Активную биферментную мембрану размещают на внешней поверхности газопроницаемой мембраны. Когда электрод находится в контакте с раствором, содержащим определяемый субстрат, гидролиз субстрата сопровождается потреблением кислорода. Таким образом, кислородный электрод измеряет степень потребления кислорода, которая пропорциональна концентрации субстрата в пробе. [c.180]

Наиболее медленна реакция (XVIII), поэтому кинетика увеличения концентрации 1г, а, следовательно, и кинетика изменения окислительного потенциала в системе h/l характеризует Сгл. В работе [198] фиксировалось время, необходимое для изменения Ен (индикаторный Pt-электрод) на 6 мВ. Это время составляло 10-Ь 100 с-в зависимости от Сгл (5—50 мГ-л- ), ошибка определений 1 %. По этой же методике rfljoKosy определяли в сыворотке и плазме крови, а при заданной концентрации глюкозы найдена активность глюкозооксидазы [199]. В качестве- индИ(Каторной системы для определения глюкозы была позднее использована система хинон-гидрохинон [200]. [c.112]

Ионселективные электроды можно приспособить для измерения активности ферментов и концентраций соединений, служащих субстратами для некоторых ферментов [15]. Например, кристаллический мембранный Hg2S/HgI-элeктpoд, предназначенный для прослеживания за иодид-ионом, можно использовать и для определения глюкозооксидазы и глюкозы, согласно уравнениям [c.186]

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и р- )-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА. [c.64]

В ферментативной иммунохроматографии также используются конъюгат фермента с определяемым веществом и специфические антитела против последнего. Однако в отличие от EMIT здесь определение не связано с изменением активности конъюгата в комплексе с антителом. Принцип метода ферментативной иммунохроматографии представлен на рис. 6.4. Определенный объем пробы смешивают с раствором, содержащим конъюгат фермент -гаптен и соответствующий ферментный реагент. В рассматриваемом примере сопряженным ферментом является пероксидаза из корней хрена, а ферментным реагентом - глюкозооксидаза. Глюко- [c.84]

Недавно описана методика быстрого определения ЬСО с помощью двухсайтового иммуноферментного анализа и иммобилизованных на электроде антител [26]. Активность глюкозооксидазы, связанной с вторыми антителами, определяли электрохимиче Ски с помощью медиатора переноса электронов (диметиламинометид-ферроцена), не прибегая к стадии отдельной инкубации. Средняя чувствительность ЬСО была равна 9 м.ед./л. [c.215]

Многие свойства ферментных меток исключительно ценны для иммуноанализа в лабораторных условиях, однако нелабораторные методы предъявляют более жесткие требования. Ферментам присущи ограниченная термостабильность, зависимость катализа от времени и температуры, чувствительность к помехам со стороны образца. В лабораторных методах для преодоления этих недостатков применяют ячейки с регулируемой температурой, точно измеряют время и предварительно обрабатывают образцы. Чтобы упростить использование индикаторных полосок, мы создали систему внутреннего стандарта, в которой компенсируются изменения каталитической активности. Эта система, состоящая из совместно иммобилизованных глюкозооксидазы и антител против пероксидазы, отличается от индикаторной полоски для определения морфия только специфичностьк антител. Поэтому можно ожидать, что цветные реакции на обеих поверхностях в одинаковой степени зависят от температуры активности фермента и от помех со стороны образца. [c.137]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология