Векторы, сконструированные на основе фага

Фаговые векторы актиномицетов сконструированы главным образом на основе фага 0С31, который в течение долгих лет был предметом генетических и молекулярно-биоло- [c.168]

На основе бактериофага Я. были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на основе фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага ( 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в Е. соИ. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клонирования, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 9— 21 т. н. п. Размножаются в бактери-40 [c.40]

Генетические способы отбора требуют значительно меньших затрат труда, чем методы скрининга, что позволило разработать новые подходы, позволяющие проводить генетическую селекцию клонов, содержащих последовательности, гомологичные любой желаемой последовательности-зонду. Это дало возможность расширить применение этого метода, распространив его на задачи, обычно решаемые с помощью более трудоемких (и часто менее специфичных) методов скрининга. В общих чертах в основе всех этих подходов лежит следующее обстоятельство хотя в случае большинства специфических эукариотических последовательностей нельзя обеспечить генетическую селекцию в клетках Е. соИ, можно сконструировать пары векторов, позволяющие селектировать продукты гомологичной рекомбинации, обусловленной гомологией последовательностей между клонами. Такая селекция основана на том факте, что процессы, подобные репликации ДНК, транскрипции, мобилизации плазмид или упаковке ДНК в фаговые частицы, могут происходить только по is-схеме в отношении соответствующего регуляторного элемента (области начала репликации, промотора, сигнала мобилизации или упаковки). Чтобы исключить рекомбинацию между векторными последовательностями, нужно подбирать векторные пары, не обладающие взаимной гомологией (или в случае рекомбинации фагов без взаимной гомологии в пределах той области, которая определяется маркерами, используемыми для селекции). Соблюдение этого главного принципа лежит в основе и скрининга фаговых клонов с использованием рекомбинации между [c.77]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

Кроме векторов — производных фага М13 получен ряд векторов на основе фагов fd и fl. На рис. 2.32 приведена структура нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага М13тр1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотикам, и поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. При этом клоны клеток Е. oli, инфицированных (трансфицированных) гибридными фагами, легко выявляются на селективных средах. [c.117]

Ранее были описаны некоторые из векторов, образованных на основе фага Я, которые были использованы для клонирования чужеродной ДНК и оказались очень удобными. На основе фага К сконструировано много векторов. Однако большинство из них либо не было использовано для клонирования чужеродной ДНК, либо было сконструировано не самым оптимальным образом. [c.161]

Наиболее подходящие кандидаты на роль векторов — естественные репликоны небольших размеров ДНК плазмид и вирусов (в том числе и фагов), но непосредственно в этом качестве их используют ре 1КО. Обычно их предварительно модифицируют или комбинируют их части для того чтобы они отвечали определенным требованиям. Самые распространенные плазмидные векторы клеток Е. oli — плазмида pBR322 и ее специализированные производные. Для этих же клеток сконструированы фаговые векторы на основе ДНК фага X и нитевидных фагов. Разработаны векторы (космиды), позволяющие отбирать рекДНК путе г их упаковки in vitro в головки фага X Создаются векторы [c.188]

Удобные векторы бьши сконструированы на основе фага М13 (разд. 5.3), представителя группы так называемых Ff- (т.е. F-специфичных нитчатых) фагов. Эти фаги инфицируют только те клетки Е. соИ, которые несут половой фактор, называемый F-фак-тором (см. введение к ч. II). Поэтому хозяином для фага М13 должен быть штамм F"", каким является штамм 71-18. У Е. соИ 71-18 /u -оперон делетирован ijS la -pro]) из геномной ДНК, но он содержится в F-плазмиде (F ас). Для облегчения работы с этим штаммом F /u -плазмиду маркируют делецией (AM 15), соответствующей N-концу р-галактоз и да-зы. Голубые бляшки, указывающие на присутствие активной -галактозидазы, обнаруживаются на агаре с Xgal только в том случае, если вектор М13 содержит область (la Za) /o -оперона, отсутствующую в F la . Каждый из двух геномов (F la [ДМ 15] и М13 la Za) детерминирует свою часть молекулы -галактозидазы, и в результате их взаимодействия внутри клетки образуется активная -галактозидаза. [c.229]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология