Генетическая селекция клонов

Генетические способы отбора требуют значительно меньших затрат труда, чем методы скрининга, что позволило разработать новые подходы, позволяющие проводить генетическую селекцию клонов, содержащих последовательности, гомологичные любой желаемой последовательности-зонду. Это дало возможность расширить применение этого метода, распространив его на задачи, обычно решаемые с помощью более трудоемких (и часто менее специфичных) методов скрининга. В общих чертах в основе всех этих подходов лежит следующее обстоятельство хотя в случае большинства специфических эукариотических последовательностей нельзя обеспечить генетическую селекцию в клетках Е. соИ, можно сконструировать пары векторов, позволяющие селектировать продукты гомологичной рекомбинации, обусловленной гомологией последовательностей между клонами. Такая селекция основана на том факте, что процессы, подобные репликации ДНК, транскрипции, мобилизации плазмид или упаковке ДНК в фаговые частицы, могут происходить только по is-схеме в отношении соответствующего регуляторного элемента (области начала репликации, промотора, сигнала мобилизации или упаковки). Чтобы исключить рекомбинацию между векторными последовательностями, нужно подбирать векторные пары, не обладающие взаимной гомологией (или в случае рекомбинации фагов без взаимной гомологии в пределах той области, которая определяется маркерами, используемыми для селекции). Соблюдение этого главного принципа лежит в основе и скрининга фаговых клонов с использованием рекомбинации между [c.77]

Генетическая селекция клонов [c.82]

Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Например, вопрос о причинах генетической неоднородности легче решать, используя клон-потомство одной клетки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта. [c.167]

Ответ, по-видимому, будет пе обязательно , и хорошим примером служит картофель. Сорта, выращиваемые в Северной Америке и Европе, произошли от небольшого образца тетраплоидных южноамериканских клонов, дополненных нечастым введением нового материала. В 1940-х годах фитофтороз еще больше уменьшил изменчивость в немногих выживших клонах. Селекция, проводившаяся с того времени, заключалась главным образом во введении доминантных генов устойчивости к болезни, и до самого последнего времени не было ни од-но1 о серьезного введения изменчивости [34]. Хотя селекционеры ежегодно выращивают миллионы сеянцев, очень немногие из них остаются для замены ведущих сортов, многим из которых более 30 лет. Здесь безусловно будет оправдан совершенно новый подход к селекции новых сортов, начав ее с самого начала. Успех новых высокоурожайных сортов риса и пшеницы показывает, что пример высокой урожайности быстро создает спрос на принципиально, новые сорта. Ряд селекционеров картофеля в США и в других странах подошли к этой проблеме, ведя отбор на увеличенный размер клубней и полевую устойчивость к фитофторозу в популяциях дикорастущего материала, зародышевая плазма которого почти не была затронута обычными селекционными программами [35]. Несмотря на то, что никаких новых сортов не было передано в производство или на испытание, эта идея ценна, если главной целью ставится введение генетической изменчивости. [c.270]

Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции очень ценным является культивирование отдельных клеток. Получение клона-потомства одиночной клетки помогает разобраться в причинах генетической неоднородности каллусных клеток, так как наблюдения в данном случае про-94 [c.94]

Первичный отбор гибридных клонов значительно упрощается, если в векторной молекуле предусмотрена специальная фенотипическая система селекции. При трансформации клеток чаще всего используют векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции отработана для бактерий, так как получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу к нескольким антибиотикам. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности. [c.34]

Возможность генетической трансформации клеток млекопитающих впервые продемонстрировал Л. Краус в 1961 г. Он выделил ДНК из костного мозга человека, гомозиготного по уЗ -полипептиду гемоглобина, и обработал этим препаратом культивируемые клетки костного мозга от пациента с серповидно-клеточной анемией ф ). В результате клетки человека приобрели способность продуцировать кроме полипептида и полипептид Однако в данном случае отбор клонов трансформированных клеток бьш значительно затруднен, так как для рассматриваемого признака не найдены условия селекции. [c.339]

Как сказано выше, приведенные здесь методики используются для отбора уникальных космидных (или плазмидных) клонов из больших библиотек с применением генетической селекции, а не скрининга библиотек путем гибридизации колоний. Этот подход получил широкое распространение использование в качестве селекционных зондов последовательностей, клонированных в pU 8 и pU 9, позволяет выделить многие космидные клоны из библиотек мыши и человека (см., например, [5, 6, 22]). [c.82]

Методом TAR-клонирования было получено 1806 первичных трансформантов. Многоступенчатый скрининг, включающий генетическую селекцию, гибридизацию колоний ш situ с меченой тотальной ДНК человека и inter-Alu-P R, показал, что 76 из них содержат вставку ДНК человека (рис. 26). Поскольку тотальная ДНК клеток соматического гибрида содержит 0.05% ДНК человека, а выход клонов 7р среди TAR трансформантов составил 4,2%, что на два порядка выше, очевидно, что избранный метод TAR-клонирования оказался примерно в 100 раз эффективнее традиционного. [c.78]

Для отбора клеток, устойчивых к неблагоприятным или стрессовым факторам, наиболее часто применяют прямую селекцию. После выбора нужной популяции необходимо проверить стабильность устойчивости к неблагопрргятному фактору. Это длительный процесс, включающий многочисленные циклы выращивания и пересадки клеток на среды, содержащие селективный фактор или без него. Из стабильных клонов необходимо попытаться регенерировать растения. Получение растений-регенерантов, а также гибридологический анализ подтверждают генетическую природу при- [c.187]

Генетическая инженерия открыла новые возможности перед учеными и биотехнологами в знвчительной мере в результате применения селекционных методов, т.е. отбора клонов микроорганизмов с определенными свойствами. Появление метода амплификации нуклеиновых кислот в последнее время привело к рождению подходов, основанных на селекции нуклеиновых кислот in vitro, i.e. на молекулярном уровне (молекулярная селекция нуклеиновых кислот). Действительно, если имеется способ среди множества нуклеиновых кислот отобрать такие, которые обладают определенными свойствами, то далее возможно размножить такие нуклеиновые кислоты с помощью амплификации (см. 7.5) и далее, если требуется, повторить селекцию еще один или несколько раз. Таким образом, все, что требуется для отбора нуклеиновых кислот с заданными свойствами, — это иметь исходный материеш для селекции и способ его отделения от остальной массы материала. [c.306]

Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих А—6 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить рас-тения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов — возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам. [c.143]

Генетическое изучение микроорганизмов, создавшее фундамент для современной селекции, стало возможным только, когда были разработаны способы выделения клоновых культур, или клонов. Клон — это генетически однородное потомство одной клётки, например колония, возникшая из одной клетки при рассеве культуры на плотной питательной среде. Исследуя свойства такой колонии, можно получить представление и о признаках породившей ее клетки. [c.70]

Потеря онкогенных свойств означает, что в этом случае трансформированные ткани невозможно идентифицировать как неопластические выросты, клетки которых легко селектировать по их способности к росту на среде, не содержащей фитогормонов. Для разрешения проблемы идентификации трансформированных клеток между повторами длиной 25 п. н. встраивают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, помещенные под контроль промоторов Т-ДНК и снабженные сигналами полиадени-лирования. Такие химерные гены устойчивости к антибиотикам эффективно экспрессируются в растительных клетках как доминантные признаки в любом генетическом окружении. Удобно, чтобы маркерные гены были тесно сцеплены с чужеродной ДНК по двум причинам. Во-первых, это позволяет осуществлять прямую селекцию трансформированной ткани растения, чтобы убедиться в переносе чужеродной ДНК. И во-вторых, это гарантирует, что фланкирующая чужеродная ДНК в конкретном трансформированном клоне, полученном в результате селекции, не была встроена в нетранскрибируемую область генома. [c.18]

В 60—70-х годах был предложен ряд систем селекции гибридных клеток, основанных на использовании для слияния линий клеток, имеющих генетические дефекты. Наибольщее распространение получила система с использованием среды ГАТ. В настоящее время система ГАТ и( пользуется в подавляющем боЛьщинстве работ по получению клонов гибридных клеток. В связи с необходимостью получения гибридов из первичных клеток большую важность приобретает разработка систем селекции клеточных гибридов, которые позволили бы обходиться без линий с генетичес кими маркерами [33, 34]. [c.190]

После каждой лигазной реакции образуется смесь разнообразных гибридных молекул ДНК, из которой целевые молекулы с заданной структурой отбирают на стадии введения в клетки и размножения гибридов, а также на стадии селекции и/или анализа гибридных клонов на предмет искомой генетической конструкции. [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология