Космиды

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг. [c.76]

Таблица 2.6. Упаковка космид путем суперинфекции жидкой культуры

Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YA -векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (в среднем IО—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК. [c.40]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Любая ДНК, находящаяся между двумя со5-сайтами, может быть упакована в оболочку фага. На этом основан метод клонирования с использованием космид , описанный в гл. 19. Важно, однако, чтобы расстояние между двумя со5-сайтами не сильно отличалось от естественной длины фага лямбда. Если это расстояние будет слишком большим или слишком малым, то ДНК не будет упакована в оболочку. Этот факт свидетельствует о том, что для завершения процесса упаковки количество ДНК должно быть достаточным и что в головке фага может поместиться совсем немного избыточной ДНК (примерно 15%). [c.346]

Используемые при клонировании фаги X могут включать до 20 т. п. н. интегрированной чужеродной ДНК. С другой стороны, космиды (гибрид фага X с плазмидой) могут включать и переносить до 54 т. п. н. чужеродной ДНК. Что бы вы выбрали при создании библиотеки ДНК человека и почему Геном человека содержит около 3-10 нуклеотидных пар. [c.293]

Рис. 2.1. Конструирование рекомбинантов по методу Иш-Горовица и Берка [10]. с — сайт клонирования, х и у — другие уникальные рестрикционные сайты. Космиды расщепляют один препарат по сайту х, другой по сайту у и обрабатывают фосфатазой. Затем каждый препарат разрезают по сайту с. Нужные плечи — те, которые несут со5-сайты в правильной (показано маленькой стрелкой) ориентации. Желательно, хстя и необязательно, индивидуально выделять необходимые фрагменты до лигирования. Методика построена так, чтобы исключить образование мультимеров космид, которые могли бы эффективно вовлекаться в упаковку.

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

По довольно сложным и пока еще недостаточно изученным причинам присутствие космид часто приводит к замедлению клеточного роста, нередко сопровождающемуся недостаточной [c.41]

Большинство космид, пригодных для использования в [c.42]

Таблица 2.3, Адсорбция и высев упакованных космид

Адсорбция упакованных космид на Е. соИ [c.51]

Эффективность получения космид сильно варьирует, и можно ожидать конечного выхода 10 —10 колоний в расчете на [c.51]

Мы успешно проводили скрининг амплифицированных библиотек, однако при этом наблюдались различия в росте колоний встречались как большие, так и очень мелкие. Космиды с Л-репликоном могут быть использованы для получения амплифицированных библиотек, но нельзя предусмотреть заранее вероятное нарушение представительства тех или иных специфических клонов. [c.52]

S.2. Хранение упакованных космид [c.56]

S.4. Упаковка индивидуальных космид с использованием суперинфекции [c.57]

Таблица 2.7. Упаковка космид путем суперинфекции культур на чашках

КОСМИДЫ. Плазмиды, содержащие встроенный os-участок фага лямбда, благодаря чему плазмидная ДНК может быть упакована in vitro в оболочку фага. [c.522]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

С помошью частичного гидролиза ДНК R. meliloti рестриктазой ЕсоШ и встраивания фрагментов длиной до 40 т. п. н. в уникальный соМ-сайт космиды pLAFRl с широким кругом хозяев был создан банк клонов хромосомной ДНК R. meliloti дикого типа (Nod+). [c.316]

Космида ( osmid) Вектор, объединяющий свойства плазмидного вектора и вектора на основе фага X. Имеет os-сайты. [c.551]

Ценность таких векторов возросла с появлением систем упаковки ДНК в фаговую частицу in vitro. Попытка объединить некоторые преимущества плазмид и фагов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (со5-сай-тами), отвечающими за упаковку ДНК фага X в фаговой частице. Такие векторы по-прежнему могут существовать в бактериях в виде плазмид, но могут быть выделены и в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. На длину этих векторов также накладывается ограничение, обусловленное размером головки фага, но такой геном не должен включать гены, необходимые для литического цикла. [c.238]

Некоторые космиды несут кроме прокариотических маркеров лекарственной устойчивости гены,, обеспечивающие селекцию эукариотических клеток. Наиболее удобные из них — это гены тимидинкиназы и устойчивости к антибиотику G418 [4] но в принципе можно использовать и некоторые другие. Наличие селектированного маркера, облегчающего введение ДНК в эукариотические клетки, может служить решающим критерием при выборе вектора. Описаны подходы, предполагающие спасение космидной ДНК в подобных экспериментах, что часто требует определенных комбинаций детерминант устойчивости [5]. [c.42]

Выбор ферментов, используемых для двойного расщепления космидного вектора при приготовлении плеч по методу Иш-Горовица и Берка [10], определяется характеристиками данной космиды. На рис. 2.1 приведена схема общего метода для любого космидного вектора. Методика, детально описанная в табл. 2.2, касается семейства космид Лориста [7, 8], где фермент X — это Sstl, фермент Y — BsffiH, а сайт клонирования Я1Пс1П1. [c.47]

Другие гес-мутации нужно использовать с осторожностью. Генотип re B sb B, который, как сообщалось, стабилизирует фаги I, содержащие повторы ДНК голова к голове [15], не поддерживает роста плазлид с репликоном рМВ1, и мы столкнулись с серьезными затруднениями при размножении космид. [c.50]

Упаковывающие экстракты могут убивать бактерии, несущие космиды. Если объемное соотнощение разведенной упаковывающей смеси и стационарной культуры больще, чем 1 4 — 1 2, титр космид резко снижается. Мы обнаружили также, что ка-кой-то компонент упаковывающей смеси способен подавлять рост бактерий на чащках, даже если он присутствует. в больщем разведении, чем 1 4. Мы разработали методику (табл. 2.3),. которая, по-видимому, позволяет решить эту проблему и обеспечивает достаточно времени для того, чтобы даже медленно экспрессирующийся ген неомицин-фосфотрансферазы (КтО экспрессировался полностью. Эта методика может быть использована как для аналитических, так и для препаративных целей, но не следует высевать на чашки более 500 мкл конечной суспензии клеток. [c.51]

Обычно на чашку диаметром 14 см можно высеять 400— 500 мкл суспензии клеток, полученных, как описано в разд. 2.2.5.3. В стандартном опыте (50 000 космид из реакции упаковки) хорошим выходом можно считать около 17 000 колоний на чашку. Применяйте чашки с толстым слоем L-arapa (100 мл на чашку), в который добавлен соответствующий антибиотик. Если возможно, используйте чашки, разлитые один-два дня назад, тогда они не будут слишком влажными. После высева, если нужно, подсушите чашки в стерильном боксе и инкубируйте, перевернув вниз крышкой, в течение 24 ч. [c.52]

Все фильтры, которые мы использовали (как найлоновые, так и нитроцеллюлозные), оказались умеренно токсичными для бактерий. Промывание фильтра водой и стерилизация помогают, но не снимают эту проблему полностью. Лучшие результаты были получены с космидами, адсорбцию которых на Е. соИ провели в точности так, как это описано в разд. 2.2.5.3, и затем высевали. Можно ожидать снижение титра на 20%, но оно может достигать и 100%. Некоторые штаммы Е.соИ очень плохо растут на пайлоновых фильтрах, и поэтому необходимо прове- [c.52]

И экспонируют при —70 °С с пленкой Kodak XAR-5. Экспозиция в течение ночи обычно дает достаточно интенсивный гибридиза-ционный сигнал с РНК-30НД01М и менее интенсивный с меченой ДНК, но это зависит от специфики космид. [c.54]

Космиды могут храниться как упакованные фаговые частицы в течение по крайней мере 6 мес при 4°С. Не стоит хранить упаковочную смесь, поскольку мы наблюдали постепенное уменьшение титра при хранении даже в течение одной недели. Космиды Лориста могут быть упакованы, а также переупакованы в Е. oli с использованием суперинфекции или путем высева на специальный штамм, упаковывающий in vivo. [c.56]

Этот метод используют для хранения, для трансформации космидами специальных линий клеток и для спасения космид, начавших терять стабильность (разд. 2АЛЛ). Методика описана в табл. 2.7. Для хранения упакованных космид просто отцентрифугируйте суспензию верхнего слоя агара в фаговом буфере, полученную, как указано в п. 3 табл. 2.7. Скорость центрифугирования должна быть достаточной, чтобы осадить суспендированный агар. Надосадочнуго жидкость отберите и храните над каплей хлороформа. [c.57]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.74 , c.74 , c.75 , c.319 ]

Гены (1987) -- [ c.238 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.47 , c.83 , c.85 , c.90 , c.100 , c.141 , c.156 , c.157 , c.167 ]

Основы генетической инженерии (2002) -- [ c.217 , c.218 , c.219 , c.220 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.246 , c.304 , c.333 , c.351 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология