Нитевидные фаги

При специфической трансдукции фрагмент бактериальной ДНК связан ковалентно с фаговой хромосомой и реплицируется в ее составе. Это позволяет мультиплицировать трансдуцируемые бактериальные гены и манипулировать ими в лабораторных условиях. Явление специфической трансдукции было открыто при работе с умеренным бактериофагом X, развивающимся в клетках Е. соИ К-12 (Morse et al., 1956). Этот фаг является представителем большого семейства лямбдоидных фагов. Он сыграл исключрггельную роль в развитии молекулярной генетики и генетической инженерии. Столь же значительна роль нитевидных фагов семейства М13. Их ДНК широко используется в качестве векторов. Поэтому для понимания многих аспектов генно-инженерных работ необходимо знать основные элементы их генетики и биологии развития. По трем причинам более детально описан фаг Х. Во-первых, это классический объект, послуживший моделью при изучении регуляции экспрессии генов вообще и временного профаммирования развития фагов в частности. Во-вторых, в 60-е годы он явился объектом, на котором была заложена база генетической инженерии — представление о векторе и возможности клонирования и экспрессии в нем чужеродных генов. В третьих, в 70-е годы [c.103]

Рис. 2.25. Схема частицы нитевидного фага

ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ НИТЕВИДНОГО ФАГА М13 [c.213]

Рис. 2.26. Генетическая организация нитевидного фага М13.

Агрегаты могут иметь пространственную или линейную симметрию, а также симметрию точечной группы. Симметричные агрегаты можно разделить на агрегаты, обладающие пространственной или линейной симметрией, а также симметрией точечной группы. Симметрия пространственной группы обнаружена в кристаллах инсулина, которые образуются в поджелудочной железе и обеспечивают форму, которая может сохраняться при пренебрежимо малом осмотическом давлении [259]. Симметрия такого же типа наблюдается в поперечнополосатых мышцах позвоночных и насекомых [215]. Линейные группы были найдены в микрокапиллярах [181], вирусе табачной мозаики [180] и нитевидных фагах [220]. Симметрия точечной группы очень распространена. Симметрия аминокислот исключает точечные группы, содержащие центры инверсии или отражения, так что возможны лишь группы, п, п2, 23, 432, 532 при /г = 1, 2, 3. .. [252, 260]. Примеры всех этих групп, за исключением 23, приведены в табл. 5.4. [c.118]

Векторы, использующие репликаторы нитевидных фагов, применяют для получ Ения однонитевых фрагментов ДНК с целью их секвенирования или приготовления гибридизационных зондов. [c.238]

В каких векторах и для чего используются элементы Z .HK нитевидных фагов [c.239]

Смит Д.П. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов // Сельскохозяйственная биология Векторные системы молекулярного клонирования. М. Мир, 1991. С. 65-90. [c.121]

Небольшие одноцепочечные нитевидные фаги типа Р , к которым относятся бактериофаги А, fd, М13 и некоторые другие, были известны достаточно давно и их биология хорошо изучена. Весьма важным свойством этих фагов явилось то, что они не вызывали лизиса бакте- [c.213]

Таким образом, одноцепочечные векторы на основе нитевидного фага М13 являются самостоятельным типом векторов, но за счет существования в жизненном цикле фага двуцепочечной репликативной формы, позволяющей работать с ней как с плазмидой, они дали строительный материал для создания следующих поколений плазмидных векторов. [c.215]

Как видим, векторная система нитевидных фагов разработана достаточно хорошо. Это обусловливает все более активное применение данных векторов для анализа нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК, для мутагенеза клонированных генов и т. д. Все чаще векторные производные ните- [c.117]

Несомненный интерес представляют также векторы на основе ДНК нитевидных фагов. Эти фаги при инфекции не лизируют клетки Е. соИ, обеспечивая высокую копийность клонированного гена и высокий выход кодируемого им белка. [c.142]

Белок рШ нитевидных фагов требуется не только для адсорбции фаговых частиц на Г-пи-лях клеток Е. соИ, но также для завершения процесса сборки вирионов и стабилизации их структуры. Задержка в присоединении рШ приводит к образованию необычно длинных частиц так называемого полифага, содержащего два и более фаговых генома. Даже фаги дикого [c.196]

Рис. 7.8. Нитевидные фаги, представляющие на поверхности частиц пептидные эпитопы, слитые с белком оболочки рШ (а) или рУШ (б)

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную репликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, названный как МП (межгенная последовательность), не существенный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репликативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепочечной молекулы в клетку Е. соИ приводит к ее репликации, синтезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и вьщеле-нию фага в среду. Инфицированная нитевиднь фагом клетка продолжает делиться, вьщеляя в окружающую среду большое количество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК. [c.120]

Целью литического развития является образование возможно большего числа фаговых частиц потомства при инфицировании бактериальной клетки-хозяина. Инфекция начинается с прикрепления к бактерии одной фаговой частицы. Икосаэдральные фаги имеют головку, содержащую ДНК, и хвостовой отросток, с помощью которого фаг прикрепляется к бактериальной клетке. ДНК впрыскивается в бактериальную клетку, частица остается вне клетки. Нитевидные фаги имеют стержнеподобную структуру их взаимодействие с клеткой бактерии изучено менее полно. [c.206]

Наконец, инфекция клеток перманентно развивающимся фагом может напоминать состояние носительства, или лизогении, но принципиально отличается по механизму. Явление перманентной инфекции свойственно определенной группе нитевидных фагов, описанных для разных бактерий. Фаги этого типа развиваются в клетке и освобождаются из нее без физического разрущения последней. Для состояния ПРФ-инфекции характерны следующие признаки 1) состояние ПРФ-инфекции вызывают фаги особого типа 2) инфицированные клетки не лизируются, делятся и освобождают очень большие (в расчете на генерацию) количества фага 3) каждая клетка является фагообразователем. [c.184]

Этот нитевидный фаг, а также близкородственные фаги fl и fd обладают однонитевыми ДНК длиной 6407 нуклеотидов, гомологичными на 97 %. У каждого из фагов имеется 10 генов, 7 из которых вовлечены в морфогенез капсиды. Белок gpVIII является ее основным структурным компонентом, а gpIII обусловливает адсорбцию фага на F-пили (см. гл. 3), через которые фаговая ДНК, обозначаемая как (+)-нить, проникает в клетки. Между II и [c.124]

Наиболее подходящие кандидаты на роль векторов — естественные репликоны небольших размеров ДНК плазмид и вирусов (в том числе и фагов), но непосредственно в этом качестве их используют ре 1КО. Обычно их предварительно модифицируют или комбинируют их части для того чтобы они отвечали определенным требованиям. Самые распространенные плазмидные векторы клеток Е. oli — плазмида pBR322 и ее специализированные производные. Для этих же клеток сконструированы фаговые векторы на основе ДНК фага X и нитевидных фагов. Разработаны векторы (космиды), позволяющие отбирать рекДНК путе г их упаковки in vitro в головки фага X Создаются векторы [c.188]

Векторы, созданные на базе ДНК нитевидных фагов. Близко -родственные нитевидные колифаги М13, П и fd обладают однони-тевои кольцевой ДНК, состоящей из 6,4 тыс. нуклеотидов, и имеют ряд свойств, позволяющих использовать их в качестве векторов. Во-первых, в их ДНК между генами П и IV (см. рис. 4.12) есть межгенный участок (спейсер), в который можно вставлять чужеродные гены. Во-вторых, размер капсиды зависит от длины упаковываемой молекулы ДНК, что позволяет клонировать фрагменты ДНК размером до 15 тыс. нуклеотидов. В-третьих, они образуют фаголизаты с высокой концентрацией (до 10 частиц в 1 мл) и, таким образом, позволяют получать большие количества векторной и клонируемой ДНК. Преимущества однонитевых векторов являются следствием особенностей развития нитевидных фагов, описанных в гл. 4. [c.213]

Метод Сэнгера значительно упростился и получил широкое распространение после появления векторной системы на основе нитевидного фага М13. Фаг М13 содержит в составе вирионов одноцепочечную кольцевую молекулу ДНК. При репликации в инфицированных клетках Е. oli молекула ДНК фага М13 проходит через стадию образования двухцепочечной репликативной формы, которую можно легко вьщелить и встроить в нее чужеродные фрагменты ДНК. Гибридные фаги в составе своих вирионов будут содержать одноцепочечную кольцевую молекулу ДНК, в которой в строго определенном месте находится одна из цепей встроенного фрагмента. [c.38]

Нитевидные фаги адсорбир)тотся на F-пи-лях Е. соИ и поэтому способны инфицировать лишь мужские (F+) бактериальные клетки. Инфекция клеток Е. соН начинается после адсорбции белка рШ, входящего в состав фаговых частиц, на конце F-пили хозяйской клетки. После этого оцДНК фага, называемая (+)-цепью, пере- [c.110]

Скорость роста заражежых клеток на 25-50 % ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении нитевидных фагов в бактериальной клетке их геном одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. Из одного литра инфицированной культуры получают несколько миллиграммов одноцепочечной и репликативной двухцепочечной форм фаговой ДНК. На одноцепочечной вирионной ДНК многие манипуляции по созданию гибридных молекул, разработанные для вирусных и плазмидных двухцепочечных ДНК, реализовать нельзя. Однако они с успехом применимы к репликативной форме генома нитевидных фагов, которая инфекцион-на в тесте трансфекции клеток Е. oli. Все это обусловило использование нитевидных фагов для создания клонирующих векторов. [c.111]

Наличие несущественной области в фаговом геноме является важным условием для конструирования гибридов. Однако у нитевидных фагов большинство амбер-мутаций приводит к гибели фага при непермиссивньк условиях. В геноме этих фагов существует лишь межгенная область IR размером 500 нуклеотидов, во многие места которой могут быть внесены изменения без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет [c.111]

ВИДНЫХ фагов используют для экспрессии чужеродных генов в клетках Е. oli. Особое направление исследований, использующее векторную систему нитевидных фагов, получило название фаговый дисплей. [c.118]

Разработанные векторные системы на основе нитевидных фагов Е. oli находят широкое применение в генно-инженерных экспериментах (см. 7.5). [c.118]

Разработанный на модельной системе фага 0X174 метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза получил дальнейшее развитие на других типах молекул ДНК, прежде всего на ДНК нитевидных фагов и плазмидах. У плазмид приходится получать одноцепочечные кольцевые формы при определенных ферментных обработках двухцепочечной ДНК in vitro, что обычно осуществить не очень просто. Поэтому наиболее широко используют нитевидные фаги, и в первую очередь фаг М13. На кольцевой одноцепочечной ДНК фага М13 удобно достраивать вторую цепь. Кроме того, создана серия векторных молекул на основе ДНК фага М13, и данный фаг с успехом используется при секвенировании клонированных последовательностей ДНК методом Сэнгера. [c.183]

Простота организации вириона и очень высокая гонцентрация вируса, достигаемая при культивировании в клетках Е. соН (более 10 2 частиц в 1 мл), позволили реализовать для нитевидных фагов подход, получивший название фаговый дисплей . Его суть заключается в том, что в составе химерных оболочечных белков нитевидных фагов экспрессируются целевые аминокислотные последовательности, которые после сборки фаговых частиц находятся (представляются) на их поверхности. При этом гены со встройками, годирующими целевые пептиды, находятся внутри таких вирионов в составе упакованного фагового генома, т. е. химерный белок и кодирующий его ген физически сцеплены (рис. 7.8). Гибридные вирионы могут быть селектированы путем аффинного связывания представленных на их поверхности чужеродных аминокислотных последовательностей с какими-либо макромолекулами. Таким образом интересующий исследователя вариант [c.196]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология