Репликативная форма ДНК

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

На молекулах репликативной формы ДНК происходит синтез не только (+)цепей ДНК, но и вирус-специфических мРНК- Следует сказать, что синтез мРН К должен предшествовать появлению новых молекул (+)цепей ДНК, так как без вирус-специфических мРНК в зараженной клетке не может появиться белок А. Трансляция фаговых мРНК приводит к накоплению вирус-специфических белков, в том числе и структурных, которые — при достаточной концентрации — начинают превращаться в сложные структуры— предшественники вирусного капсида. Генерируемые на этой стадии (+)кольца в результате специфических взаимодействий с белками фага вовлекаются в процесс сборки вириона. Тем самым предотвращается ставший уже ненужным переход -Ь)цепей в репликативную фор.му. [c.274]

Если репликативная форма ДНК фага X замкнута в кольцо, то ДНК зрелых частиц имеет, как известно, линейную форму. В отличие от линейной ДНК Т-четных фагов ДНК фага X при освобождении из вириона самопроизвольно образует либо кольца, либо линейные агрегаты . Это свидетельствует о том, что ДНК фага Я имеет липкие концы, соединяющиеся друг с другом за счет специфического спаривания оснований. Непосредственное определение нуклеотидной последовательности подтвердило это предположение. На рис. 15-23 показана [c.262]

Рис. 57. Схема образования репликативной формы ДНК фага, содержащего с зрелом вирусе однонитевую ДНК

Из рис. 7 видно, что в ДНК фракции I в норме заметны структуры, напоминающие репликативные формы ДНК — развилки . [c.51]

Рис. 2.32. Рестрикционные карты репликативных форм ДНК векторных фагов Г(1

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную репликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, названный как МП (межгенная последовательность), не существенный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репликативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепочечной молекулы в клетку Е. соИ приводит к ее репликации, синтезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и вьщеле-нию фага в среду. Инфицированная нитевиднь фагом клетка продолжает делиться, вьщеляя в окружающую среду большое количество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК. [c.120]

Репликативная форма ДНК вируса 0 Х174 (дополнение 4-В)—небольшая кольцевая молекула из —5000 пар оснований — обрабатывалась профлави-ном [82]. Связывание 0,06 молей профлавина на моль нуклеотидов сводило X к нулю. Отсюда была получена оценка 6 = 0,055 это означает, что при температуре 25°, pH 6,8 и ионной силе 0,2 в молекуле содержится —26 супервитков. На плотность супервитков сильно влияют температура, pH и ионный состав. В общем случае а становится менее отрицательной на — 3,3х ХЮ при повышении температуры на 1° [86с]. Например, для ДНК вируса 0 Х174 при ионной силе 0,2 а получалась равной —0 витков) при 75°С. [c.141]

Для вирусов, вирионы которых содержат однонитевую ДНК, первой стадией репликации является синтез в инфицированной клетке комплементарной цепи, т.е. образование двунитевой репликативной формы ДНК. При этом цепь ДНК, входящая в вирион, называется плюс-цепью, а создаваемая на ней, как на матрице, комплементарная ДНК - минус-д епью. Инициация и элонгация синтеза ми-нус-цепи идут с участием ферментов клеток хозяина. Механизмы инициации достаточно разнообразны. Например, при синтезе минус-цепи ДНК фаг-а tpX 174 в инициации участвует сложный комплекс белков, включающий праймазу. ДНК фага М13 имеет специальную шпильку, стебель которой работает как полноценный двунитевой фрагмент по отношению к РНК- юлймеразе клетки. Поэтому затравка образуется с помощью хозяйской РНК-4Юлимеразы. [c.194]

Одна из наиболее упо фебляемых схем такого мутагенеза приведена на рис. 85. С этой целью исходный ген встраивают в двунитевую репликативную форму ДНК фага М13, зрелые частицы которого содержат однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепь, см. 5.7). Введение полученной рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки приводит к накоплению частиц бактериофага, содержащих однонитевую рекомбинантную ДНК, из которых ее можно выделить и использовать в качестве матрицы для ДНК-полимеразы. Для репликации используют специально сконструированный праймер, который соответствует участку встроенного гена, содержащему кодирующий элемент заменяемой аминокислоты. При этом по обе стороны от этого тринуклеотнда праймер полностью комплементарен рекомбинантной ДНК, а в пределах этого тринуклеотида заменен таким образом, чтобы в образующейся при репликации минус-цепи образовалась запла- [c.305]

Таким образом, выделив репликативную форму ДНК и расщепив ее в области несущественного участка, можно с помощью лигазы вставить в место разрыва чужеродную ДНК. Введение рекомби-иантной двухцепочечной молекулы в клетку Е. oli приводит к ее [c.432]

Нуклеотидный состав ДНК, синтезированных на одноцепочечных матрицах. Определите нуклеотидный состав ДНК, синтезированной на матрице, представляющей собой двухцепочечную кольцевую ДНК фага фХ174 т.е. репликативную форму ДНК этого фага), если нуклеотидный состав одной из цепей таков А-24,7%, G -24,1%, С -18,5% и Т -32,7%. Какое допущение необходимо сделать, чтобы решить эту задачу [c.925]

Этот кажущийся парадокс был объяснен Снигелманом [53], установившим, что в опытах in vitro обычно используют фрагментированную ДНК. Он показал, что если препарат репликативной формы ДНК из фага фХ17А очистить очень аккуратно, то он окажется состоящим из целых двухцепочечных колец. Если затем для синтеза РНК использовать такие неповрежденные кольца, образовавшаяся РНК оказывается комплементарной только одной цени, а именно той, которая комплементарна исходной, зрелой , цени двухцепочечной формы. Если же РНК получают с помощью ДНК, находящейся в виде разорванных на части колец, то цепи РНК оказываются комплементарными обеим цепям ДНК. Такой механизм подбора цепей, видимо, является уникальной особенностью кольцевой двухцепочечной ДНК. [c.238]

В клетках Е. соИ, зараженных фагом MS2, меченным по фосфору, у/ке через несколько минут после заражения образуется меченое соединение, устойчивое к действию РНК-азы [171]. Оно было идентифицировано как двухценочечная репликативная форма РНК фага MS2 (стр. 59 и стр. 161), во-первых, по профилю тепловой денатурации и температуре плавления, во-вторых, по поведению при центрифугировании в градиенте плотности сернокислого цезия и, в-третьих, по локализации радиоактивности в одной из цепей ( плюс -цепь), представляющей родительскую РНК фага MS2. Эта репликативная форма, но-видимому, аналогична репликативной форме ДНК фага фХПА (стр. 214). [c.249]

Из клеток, зараженных фагом ФХ174, наряду с одноцепочечной ДНК, присутствующей в вирусных частицах, можно с помощью центрифугирования в градиенте плотности и хроматографией на МАК получить двухцепочечный комплекс ДНК с вдвое большим молекулярным весом зэ — так называемую репликативную форму ДНК фага ФХ174. Присутствие в зараженной вирусом клетке форм вирусной ДНК, отличающихся по своей структуре от ДНК вирусных частиц, показано и для многих других вирусов. [c.32]

Подобные ковалентно-связанные циклические структуры ДНК были доказаны для ДНК фага ФХ174 и соответствующей репликативной формы ДНК, ДНК вирусов полиомы, папилломы, простого герпеса, вируса 5У40, репликативных форм ДНК ряда других вирусов, ДНК митохондрий (обзоры —см.26, 78) Ддд ДНК митохондрий было показано электронно-микроскопически, что кольцевые молекулы могут соединяться между собой как звенья в цепи, образуя димеры, тримеры и тетрамеры, аналогичные катенанам - з. [c.48]

Доказательства существования таких ДНК были рассмотрены в гл. 1 (см. стр. 48). Эти молекулы отличаются от линейных и не-ковалентно-замкнутых циклических ДНК значительно более высоким коэффициентом седиментации 2. Так, например, репликативная форма ДНК фага ФХ174, обладающая ковалентно-замкнутой структурой "2, имеет коэффициент седиментации г 2 М ЫаС при нейтральных значениях pH, равный 21 5, тогда как эта же ДНК, но с разрывами в одной из цепей имеет коэффициент седи- [c.256]

Известны три типа двухцепочечных кольцевых ДНК- Первый из них — ковалентно замкнутая кольцевая ДНК. Такие ДНК имеют сравнительно небольшой молекулярный вес.Примером указанных ДНК служат нуклеиновые кислоты вирусов полиомы и ЗУ 40, репликативная форма ДНК бактериофага ФХ174 В их молекулах обе полинуклеотидные цепи не имеют ни единого разрыва, поэтому любое изменение вторичной структуры, связанное с изменением количества остатков на один виток спирали, влечет за собой перестройку третичного строения ДНК. [c.47]

Ковалентно замкнутая кольцевая двухцепочечная ДНК — особый тип макромолекулярной организации ДНК. Например, ДНК вируса полиомы и ЗУ 40 вируса, а также двухцепочечная репликативная форма ДНК бактериофага ФХ174. Такие ДНК характеризуются сравнительно небольшой мол. массой. Обе цепи в их молекулах не имеют ни одного разрыва, вследствие чего любое изменение спирали влечет за собой перестройку третичной структуры. [c.56]

Какой белок ответствен за первоначальное расплетание двух цепей родительской молекулы Эту функцию связывают с мутациями гер, которые замедляют движение репликационной вилки. Белок Rep представляет собой АТРазу, зависимую от одноцепочечной ДНК. В присутствии АТР совместное действие белков Rep и SSB приводит к разделению двухцепочечной репликативной формы ДНК фага фХ174, несущей разрыв в одной из цепей, на составляющие ее отдельные цепи. Вероятно, белок Rep расплетает цепи, а белок SSB затем фиксирует их в одноцепочечном состоянии. [c.424]

Последовательности нуклеотидов липких концов, образующихся под действием рестриктаз типа IIS, являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной исходной последовательности, которая задается уникальными последовательностями нуклеотидов в липких концах рестрикционных фрагментов ДНК. Например, при расщеплении рестриктазой типа IIS репликативной формы ДНК фага фХ174 образуется 14 фрагментов, которые in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием инфекционной фХ 174-ДНК. [c.54]

Если обе нити циклической двуспиральной ДНК, например ДНК вируса 5У40 или репликативной формы ДНК фага 0X174, замкнуты, т. е. сахарофосфатная цепь непрерывна, то они могут иметь суперспиральную или суперскрученную конформацию. [c.229]

Так, П. Мозес и К. Хориучи (1979 г) продемонстрировали, что репликативную форму ДНК фага fl, расщепленную рестриктазой Hgal на шесть фрагментов, можно с помощью ДНК-ли-газы с высокой эффективностью собирать в биологически активную кольцевую ДНК, дающую после трансфекции клеток начало фаговому потомству. При гидролизе той же фаговой ДНК рестриктазой класса II, формирующей одинаковые липкие концы, уже практически невозможно из шести фрагментов в процессе лигазной реакции восстановить молекулу ДНК нативной структуры, так как все фрагменты будут объединяться статистически в а1шхразлишшх-ком-бинациях., - - [c.21]

Первый гибридный фаг М13 был описан Дж. Мессингом с соавторами в 1977 г. Репликативная форма ДНК фага М13 гидролизуется рестриктазой на 10 фрагментов, имею- [c.112]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология