Трансформация компетентность

Б. Трансформация компетентных клеток одноцепочечной ДНК. фага М13 [c.194]

Пояснение. Результат лигирования обычно известен только после трансформации компетентных клеток. Цель постановки указанных контролей состоит в том, чтобы удостовериться, что все этапы, предшествующие трансформации, и сама трансформация [c.59]

Трансформация компетентных клеток Е. соИ [c.65]

Е. Трансформация компетентных бактерий [c.82]

После получения вектора, соединенного с кДНК, можно приступать к трансформации компетентных, т. е. способных к трансформации, клеток. При взаимодействии векторов, нагруженных кДНК, с компетентными клетками в некоторые из них проникает чужеродная ДНК, что ведет к образованию трансформированных клеток. Эти клетки отбирают и клонируют с целью получения копий целевого гена. Идентификация клеток, несущих целевой ген, часто определяет успех проведения генно-инженерных разработок и проводится в два этапа. [c.501]

Для трансформации компетентной культуры достаточно добавить к ней очень малые количества трансформирующей ДНК — начиная с сотых долей микрограмма. Оптимальная концентрация — 0,1—1 мкг/мл, и при дальнейшем ее увеличении рост числа трансформантов обычно прекращается, вероятно, в связи с насыщением всех находящихся в культуре компетентных клеток. Если добавлять смесь различных ДНК в насыщающих концентрациях, то, очевидно, происходит конкуренция за участки адсорбции на клеточной поверхности и количество трансформантов снижается. Следует отметить, что адсорбировать ДНК могут не только компетентные, но и некомпетентные клетки. Однако последние связывают ДНК непрочно (обратимо, или неспецифически). [c.116]

Трансформация компетентных клеток Е. oli. К 0,2 мл компетентных клеток Е. ali добавляют 1—10 мкл плазмидной ДНК (1 —100 нг) и инкубируют клетки во льду в течение 30—45 мин. Затем клетки подвергают тепловому шоку, помещая их на 5—10 мин при 42°. Добавляют к клеткам 0,5 мл среды LB и инкубируют с аэрацией при 37° в течение 2 ч. После инкубации высевают по 0,1 мл культуры на чашки с селективной средой и инкубируют в течение 16—24 ч. [c.185]

Также была предложена оригинальная стратегия получения делеционных вариантов субклонов, основанная на применении все той же экзонуклеазы III [Henikoff, 1990]. Суть этой стратегии заключается в образовании сначала двуцепочечной структуры из одноцепочечного фага М13 или ему подобного и уже затем создании делеций. Так, на первом этапе проводится отжиг олигонуклеотидного праймера, расположенного таким образом, чтобы ДНК-полимеразой при удлинении праймера в первую очередь была скопирована сама векторная последовательность. Построение цепи ДНК осуществляется с помощью ДНК-полимеразы фага Т4, поскольку этот фермент характеризуется высокой скоростью полимеризации, не несет 5 — 3 -экзонуклеазной активности и не вызывает смещение цепей как некоторые другие ДНК-полимеразы. В результате образуется двуцепочечная молекула ДНК, несущая один ник между 5 -концом праймера и 3 -концом вновь синтезированной цепи ДНК. Далее в действие вступает экзонуклеаза III, работающая в обратном направлении и расширяющая ник до весьма протяженных участков одноцепочечной ДНК. Отбор аликвот данной реакции по времени расщепления приводит к формированию некоторого пула молекул с одноцепочечными участками различной протяженности. После удаления образовавшихся одноцепочечных участков S1 нуклеазой, репарации концов и их лигирования проводится трансформация компетентных клеток E. oli полученными конструкциями. Таким образом, как можно видеть из рис. 8.12, в результате всех этих процедур об- [c.259]

Для связывания двухцепочечной ДНК с поверхностью клетки В. subtilis необходимо участие белка 38,5К. Этот белок специфичен для компетентного состояния клетки и имеет молекулярную массу 38,5 кДа. 1Сак показали Б. Вос-ман с соавторами (1988 г.), важное значение для дальнейших этапов трансформации играет белковый комплекс 70К, а также белки 14К и 28К. Расположенный на плазматической мембране комплекс 70К состоит из двух субъединиц специфичной нуклеазы 17К и двух субъединиц белка 18К, являющегося регулятором активности данной нуклеазы. (Полагают, что 18К ингибирует нуклеазу 17К, предотвращая чрезмерный гидролиз молекул ДНК.) Белки 14К и 28К также представляют собой нуклеазы, специфичные для компетентного состояния. Причем белок 14К образуется в результате процессинга нуклеазы 17К, а 28К является димером 14К. В целом следует констатировать, что пока понятны лишь отдельные моменты процесса хромосомной трансформации компетентных клеток бацилл. [c.235]

Рис. 10.3. Модели трансформации компетентных клеток 5. subtilis разными типами молекул ДНК 1-7).

Удивительным оказался тот факт, что эффективную трансформацию компетентных клеток В. subtilis можно осуществлять лишь муль-тимерными формами плазмид, у которых полный плазмидный геном повторен в прямой ориентации ( голова к хвосту ) несколько раз. Необходимо отметить, что в препаратах плазмид такие формы всегда присутствуют в небольшом количестве, но их обычно не принимают во внимание. Эффективность же трансформации компетентных клеток В. subtilis специально очищенной мономерной суперкольцевой ДНК в 103-1 O раз ниже, чем нефракционированным препаратом плазмиды, содержащим и мульти-мерные формы. [c.237]

Особенности механизма плазмидной трансформации компетентных клеток В. subtilis, в частности, необходимость мультимерных форм плазмид, затрудняют клонирование фрагментов ДНК в составе гибридных плазмид в данной системе. Несомненно, получать in vitro мульти-мерные молекулы гибридных плазмид гораздо сложнее, чем мономерные. Поэтому было разработано несколько вариантов трансформации компетентных клеток В. subtilis, позволяющих использовать мономерные плазмиды. [c.237]

Образование делеционных вариантов гибридных плазмид может происходить не только в процессе трансформации компетентных клеток В. subtilis, но и при пассировании плазмидосодержащих культур бактерий. Возникшие in vivo делеционные производные плазмид, как правило, при дальнейших пассажах культуры стабильно сохраняют свою структуру. [c.268]

Д. Симон и А. Чопин (1988 г.) сконструировали серию pIL-плазмид из родительской плазмиды pHV1301, которая является делеционным вариантом pAN l, спонтанно полученным при трансформации компетентных клеток В. subtilis. В основе использованного подхода — введение полилинкера в состав плазмиды и уменьшение ее размера (рис. 11.2). [c.273]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология