Ген устойчивости к ампициллину

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атр ) в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы АЬс и укороченный ген -галактозидазы (la Z). Ген, который хотят клонировать, встраивают в Ab l-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

Рис. 7.13. Обобщенная схема экспрессирующего вектора млекопитающих. Полилинкер (ПЛ) и селективный маркер (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора р) и сигнала полиаденилирования (j>a). Репликация вектора в Е. oli и в клетках млекопитающих обеспечивается сайтами инициации репликации ori и соответственно. Для отбора трансформированных клеток Е. oli используется ген устойчивости к ампициллину (АтрО

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Как видно из рис 65,терминальная трансфераза катализирует реакцию присоединения гомополимерных последовательностей дезоксицитидина Таким образом создаются предпосылки для последующего клонирования, в частности, используя плазмидный вектор (см) PBR322, несущий гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину После расщепления рестриктазой (см) Pst 1 (из Providen ia stuartii) эта плазмида имеет гомополимерные последовательности dr [c.187]

Большая часть манипуляций, необходимых для конструирования плазмид и их размножения, осуществляется в Е.соИ. Поэтому такие плазмиды обязательно должны нести область начала репликации, наличие которой необходимо для их репликации в клетках Е. oli. Чаще всего с этой целью в состав вектора вводят соответствующие сегменты бактериальных плазмид, например pBR322. Кроме этого необходим маркер для селекции трансформантов в E. oli в случае плазмиды, показанной на рис. 7.1, эту функцию выполняет ген устойчивости к ампициллину. [c.211]

Рис. 9.4. Линейная карта вектора pMV-7, содержащего внутренний промотор [26]. pMV-7 — производное Mo-MSV, содержит уникальные рестрикционные сайты oRI и h indlU, которые используются для клонирования генов, функцию селективного маркера выполняет ген neo под контролем .4-промотора (Р(к) вируса герпеса простого. Волнистой линией обозначены ген устойчивости к ампициллину (Лр ) и другие плазмидные последовательности, которых нет в вирусных геномах — производных векторной ДНК.

Когда решается вопрос о том, в какую область вектора ввести клонируемый фрагмент, необходимо учитывать, что вставка в функционально важную последовательность неизбежно нарушит какое-либо из свойств вектора. Впрочем, такое нарушение может быть использовано в целях селекции рекомбинантных молекул. Например, широко распространенный плазмидный вектор рВК322 несет гены устойчивости к двум антибиотикам—ампициллину и тетрациклину. Для клонирования часто используется уникальный Рей-сайт в гене устойчивости к ампициллину. Встраивание чужеродного фрагмента ДНК приводит к инактивации гена ампициллинустойчивости, и бактерии, несущие такую рекомбинантную плаз- [c.40]

Вместе с тем имеются данные о выживании ГММО в окружающей среде. Установлено, что бактерии Е. соИ, содержащие рекомбинантные плазмиды с клонированными генами (генами устойчивости к ампициллину и генами синтеза фермента люциферазы), при определенных условиях способны выживать в лабораторных водных микроэкосистемах. Рекомбинант- [c.242]

Например, если векторная плазмида детерминирует устойчивость одновременно к тетрациклину и ампициллину (Тс АрО и при встройке в нее чужеродного фрагмента нарушается ген устойчивости к ампициллину, то гибридная плазмида будет обусловливать фенотип клетки-хозяина Тс> Ар , т. е. устойчивость к тетрациклину и чувствительность к ампициллину. Плазмиды после встройки в них фрагментов ДНК вводят в клетки, культуру высевают на чашки с агаризованной питательной средой, в которую добавлен тетрациклин. При этом вырастают колонии клеток, содержащих или исходную векторную плазмиду, или гибридные плазмиды. Затем колонии перепечатьшают на чашки с ампициллином и чашки с тетрацик- [c.34]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология