Бактериальные плазмиды

Рис. 2.9. Микрофотография бактериальной плазмиды, полученная с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

Векторы для клонирования. Используют для увеличения количества (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор, посредством репликации. В этом качестве наиболее часто используются бактериальные плазмиды и фаги. Для клонирования больших фрагментов генома используют векторы — искусственные бактериальные и дрожжевые хромосомы (ВАС и YA ). [c.36]

Рис. 22.5.4. Включение гена препроинсулина в бактериальную плазмиду из мРНК через кольцевую ДНК, связывание, рестрикционное расщепление, отжиг

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

Размеры двуспиральных ДНК характеризуют числом пар нуклеотидов (п. н.), приходящихся на одну макромолекулу. Для клеточных и вирусных ДНК они варьируют в очень широких пределах. Так, например, наиболее изученные бактериальные плазмиды и ДНК многих вирусов и бактериофагов содержат несколько тысяч пар нуклеотидов (т. п.н.), ДНК половых факторов бактерий, митохондрий и хлоропластов — несколько десятков или сотен т. п. н. Размеры хромосом бактерий — несколько миллионов п. и., дрожжей — порядка 10 п. н. Суммарная длина хромосомных ДНК человека составляет около 3-10 п. н. [c.15]

Другие способы инициации репликации целесообразно рассмотреть в связи с вопросом о регуляции репликации. Молекулярные основы подобной регуляции лучше всего изучены в случае некоторых бактериальных плазмид. [c.63]

Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отождествляются (А А Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия представляет собой один из методов науки биотехнология В основу генноинженерных методов заложена способность ферментов — рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК Поэтому методами генетической инженерии добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содержащих заданный участок ДНК Другими словами клонирование ДНК — это получение ее генетически идентичных копий [c.179]

Возможно, что ген MLS-резистентности в бактериальных плазмидах происходит из генома стрептомицетов - продуцентов макролидов. [c.245]

Использование бактериальных плазмид в качестве векторов для клонирования. Клетки бактерий содержат хромосомную ДНК. Однако помимо хромосом бактерии содержат большое число небольших (1—25 т. н. п.) кольцевых молекул ДНК. Такие кольцевые молекулы называют плазмидами. Некоторые плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, представленные большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, биохимически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость бактериальной клетки к последним. [c.37]

НЕСОВМЕСТИМОСТЬ. Невозможность совместного существования в одной клетке определенных бактериальных плазмид. [c.524]

Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YA -векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (в среднем IО—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК. [c.40]

Наиболее распространенным методом генной инженерии является создание рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, бактериальных плазмид. Плазмиды — это кольцевые двухспиральные молекулы ДНК, содержащие несколько тысяч пар нуклеотидов. В исследованиях по генной инженерии обычно используют кишечную палочку Е. соИ. Получение рекомбинантных молекул ДНК включает ряд последовательных этапов [c.496]

Клонирование фрагмента ДНК позволяет получить любое его количество из одной-единственной молекулы. (Клоном называется большое число клеток или молекул, идентичных исходной родительской клетке или молекуле). Клонирование ДНК возможно благодаря способности бактериальных плазмид и фагов продолжать нормально функционировать после встраивания в их геном дополнительных последовательностей ДНК. [c.236]

Рис. 15.21. Получение гибридной ДНК путем вставки фрагмента эукариотической ДНК в бактериальную плазмиду (упрощенная схема). Чужеродную ДНК и ДНК плазмиды расщепляют in vitro с помощью одной и той же рестрикционной эндонуклеазы. При этом получаются фрагменты с липкими концами (одноцепочечными концевыми участками с комплементарными основаниями). В результате смешивания таких фрагментов и обработки лигазой образуются плазмиды с включенной в них эукариотической ДНК. Эти гибридные ДНК можно вводить в подходящие бактерии и размножать, получая массовые культуры трансформированных клонов. Из такого клона удается выделить чужеродную ДНК.

Открытию транспозиции и других перестроек в ДНК в какой-то мере способствовали наши знания об удивительной способности последовательностей ДНК приспосабливаться. Чужеродную ДНК можно ввести в эукариотические клетки, где она выживает и может экспрессироваться. В некоторых случаях чужеродная ДНК остается внехромосомной, иногда она интегрируется в геном. Взаимоотношения между внехромосомными и геномными формами необычны и скорее зависят от случайных и в некоторой степени непредсказуемых событий, чем напоминают взаимный обмен между свободными и интегрированными формами бактериальных плазмид. Тем не менее процесс может привести к стабильному изменению в геноме. Например, ДНК, инъецированная в яйцеклетки животных, способна включаться в геном, наследоваться и функционировать. Благодаря этому оказывается возможным осуществлять весьма сложные манипуляции с последовательностями ДНК как в природных, так и в экспериментальных условиях. [c.490]

Особая ценность протопластов для селекции растений определяется целым рядом их свойств. Во-первых, протопласты можно получать в большом количестве и отбирать из них разновидности с полезными свойствами. Хотя сами протопласты генетически единообразны, формирующиеся из них каллусы дают растения, существенно различающиеся по внешним признакам. Во-вторых, отсутствие клеточной стенки облегчает слияние протопластов и образование гибридов. Поскольку при этом сливаются соматические, как минимум диплоидные, клетки, селекционер растений получает в свои руки мощный инструмент для отбора. В-третьих, в отсутствие клеточной стенки облегчается-захват чужеродной ДНК — фрагментов молекул или же бактериальных плазмид, в результате чего формируются растения с совершенно новым набором признаков. [c.383]

Выявление свойств бактериальной плазмиды обычно начинают на генетическом уровне. Если есть подозрение на то, что какой-то бактериальный признак обусловлен плазмидой, в экспериментах по переносу генов часто можно показать передачу плазмидных детерминант независимо от хромосомных. Если же этот признак исчезает при обработке бактериальной популяции излечивающими агентами, такими, как акридиновый оранжевый или бромистый этидий, то можно быть почти уверенным в его плазмидном происхождении. В большинстве случаев, однако, необходимо непосредственно убедиться в существовании плазмиды и в том, что именно она определяет изучаемый генетический признак. [c.129]

Эндорфин — опиат мозга, состоящий из 31 аминокислотного остатка, был синтезирован в генетически сконструированных клетках в 1980 г. группой ученых из Австралии и США. -Эндорфин получен в клетках Е. соН в виде гибридного белка с -галактози-дазой. Процедура синтеза -эндорфина включала получение путем обратной транскрипции мРНК — кДНК, кодирующей белок-предшественник, содержащий помимо последовательности -эндорфина последовательность АКТГ и -липотропина ( -JITT), в дальнейшем удаляемые. -Эндорфин, полученный из гибридного белка и тщательно очищенный, обладал значительной биологической активностью. Он специфически взаимодействовал с антисывороткой против -эндорфина. От -эндорфина человека генно-инженерный -эндорфин отличался по двум аминокислотам, и эти отличия можно было легко устранить на нуклеотидном уровне путем замены двух кодонов в ДНК бактериальной плазмиды. [c.139]

Последовательности бактериальных плазмид, включающие область начала репликации для размножения в Е. соИ и селективный бактериальный маркер. [c.241]

Некоторые бактериальные плазмиды (обычно достаточно крупные) способны передаваться из одной клетки в другую, иногда даже в клетку другого вида бактерий (как правило, не слишком далекого). Такие плазмиды называются трансмиссивными, и их свойства определяются группой генов, ответственных за перенос (гены 1га). Трансмиссивные плазмиды кодируют специальные ворсинки, половые пили, которые появляются на поверхности клеток, содержащих плазмиды, и способны специфически связываться с поверхностью бесплазмидных клеток. Последующее сокращение пиля притягивает клетки друг к другу и. между ними образуется мостик, через который плаз.мидная ДНК может передаться в новую клетку. га-Гени разных плазмид часто сходны между собой. [c.111]

В течение многих лет было известно, что гены и даже целые участки хромосом высших о,рганизмов могут иногда перемеш,аться с одного места на другое. В случае кукурузы контролирующиеэлементы перемещаются с одного участка на другой, изменяя выражение генов и напоминая своим поведением способных к включению бактериальных плазмид [233с]. Не исключено, что это явление связано с присутствием в ДНК эукариот большого числа длинных палиндромных последовательностей [235а]. [c.288]

X [260]. Аналогичным образом гены gfai-оперона Е. соН удалось включить при помощи фага % в геном вируса SV40. Важная особенность зтих методов состоит в том, что в них используется молекулярное клонирование новых комбинаций ДНК, включенных в бактериальную плазмиду [261]. Для этой цели были использованы плазмиды, способные к репликации в клетках Е. соИ. [c.295]

Вектор (Ve tor) Самореплицирующаяся молекула ДНК (например, бактериальная плазмида), используемая в генной инженерии для переноса генов от орга-низма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей. [c.545]

Незначительные ограничения этого метода компенсируются информацией, которая может быть получена из независимых анализов комплиментарных цепей. Применение ферментов в этом методе ограничивается введением метки в концевой фосфат и рестрикционным расщеплением цепей на блоки подходящей длины, примерно в 100—150 остатков, с частичным их перекрыванием. Метод нашел наибольшее применение в определении последовательности оснований контролирующих областей генов, например для исследования дуплекса в 223 пары оснований, представляющего собой ген 5S РНК пекарских дрожжей и имеющего промоторный и тер-минаторньй участки транскрипции [24]. Другой прекрасный пример использования этого метода — установление полной первичной структуры -глобиновой мРНК кролика, структура которой была закреплена получением с помощью транскриптазы соответствующей ей циклической ДНК [25]. В ходе амплификации этой циклической ДНК клонированием бактериальных плазмид (см. разд. 22.3.4) были потеряны 13 остатков с 5 -конца. К счастью, их последовательность удалось установить в результате исследований с использованием метода плюс и минус [26]. Совместное применение этих методов позволило установить последовательность гена длиной в 589 пар нуклеотидов. [c.192]

Этот фермент рестрикции делает четыре разреза в идентичных палиндромных концах сконструированной таким образом ДНК, а также делает один идентичный разрез в кольцевой ДНК из бактериальной плазмиды Е. oli (Плазмиды являются маленькими [c.213]

Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было-обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов контролирующих начало репликации. Если уж репликация началась, то она идет с относительно постоянной скоростью при любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в случае много-копийных плазмид, чем малокопийных. [c.305]

Мы точно не знаем, какая особенность последовательности ДНК в пределах этой границы необходима для узнавания РНК-полимеразой. Поскольку стартовая точка далеко не всегда попадает в эту область, можно заключить, что от геометрии комплекса зависит, в каком месте происходит инициация. Возможно, когда фермент связывается слева от стартовой точки, комплекс способен вытягиваться по направлению хода транскрипции. Блок ТАТА всегда расположен внутри промоторной области его особое значение для транскрипции подтвердилось в опытах с введением двух мутаций в ген, кодирующий ко-нальбумин у цыпленка. Замена Т в третьей позиции блока Хогнесса на G приводит к возникновению мутации, сильно ослабляющей транскрипцию гена. Эффект этот обусловлен не просто изменением состава пар оснований, так как замена, приводящая к появлению А, оказывает такое же действие (при этом только изменяется ориентация пары Т—А). Следовательно, важное значение имеет, видимо, точная последовательность блока ТАТА. Как было показано, этой области достаточно для инициирования транскрипции in vitro. Об этом свидетельствует тот факт, что последовательность положения от — 32 до — 12, относящаяся к области поздних генов транскрипционной единицы аденовируса, встроившись в различные участки ДНК бактериальной плазмиды, способна инициировать транскрипцию на расстоянии 30 п. н. от места своего включения. [c.150]

Большая часть манипуляций, необходимых для конструирования плазмид и их размножения, осуществляется в Е.соИ. Поэтому такие плазмиды обязательно должны нести область начала репликации, наличие которой необходимо для их репликации в клетках Е. oli. Чаще всего с этой целью в состав вектора вводят соответствующие сегменты бактериальных плазмид, например pBR322. Кроме этого необходим маркер для селекции трансформантов в E. oli в случае плазмиды, показанной на рис. 7.1, эту функцию выполняет ген устойчивости к ампициллину. [c.211]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология