Другие плазмидные векторы

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Рис. 9.4. Линейная карта вектора pMV-7, содержащего внутренний промотор [26]. pMV-7 — производное Mo-MSV, содержит уникальные рестрикционные сайты oRI и h indlU, которые используются для клонирования генов, функцию селективного маркера выполняет ген neo под контролем .4-промотора (Р(к) вируса герпеса простого. Волнистой линией обозначены ген устойчивости к ампициллину (Лр ) и другие плазмидные последовательности, которых нет в вирусных геномах — производных векторной ДНК.

Рекомбинантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плазмидная ДНК из донорской клетки в реципиент-ную в естественных условиях. Некоторые плазмиды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и реципиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. Большинство плазмид, которые используются в работах с рекомбинантными ДНК, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в реципиентные клетки путем конъюгации. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происходит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами. Таким образом, введя в клетку, несущую мобилизуемый плазмидный вектор, плазмиду с конъюгативными функциями, можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. [c.77]

Вначале чужеродные гены вводили в ДНК хлоропластов в составе плазмидного вектора, несущего неселективную чужеродную ДНК и селективный маркер, например ген устойчивости к антибиотику, фланкированные специфическими последовательностями хлоропластной ДНК (рис. 17.7). Такая стратегия была весьма эффективной, однако нередко селективный маркер мешал экспрессии фланкирующих хлоропластных генов. Чтобы решить эту проблему, разработали стратегию, в которой селективный маркер и чужеродный ген не были физически связаны друг с другом. Для этого растения табака трансформировали смесью одинаковых количеств двух разных плазмид одна содержала селективный маркер (ген устойчивости к спектиномицину), фланкированный ДНК из одного участка хлоропластной ДНК, а вторая — чужеродный ген (ген устойчивости к канамицину), фланкированный последовательностями из другого участка [c.385]

Технология рекомбинантных ДНК открывает новые замечательные возможности для дальнейшего изучения экспрессии генов и функционирования их белковых продуктов у самых разных организмов. Что касается вируса гриппа, то молекулярное клонирование позволило не только быстро накопить обширную информацию о первичной структуре всех вирусных генов (хотя, например, для НА-гена этот подход оказался наиболее продуктивным), но и конструировать in vitro определенные мутанты. В настоящее время гены, кодирующие белки НА, NA, М и NS, уже вводятся в составе бактериальных плазмидных векторов в эукариотические клетки, где и экспрессируют соответствующие полипептиды [20]. В этих опытах обычно используют плазмидные конструкции, несущие промоторы SV40, поэтому клеточные РНК-полимеразы II могут эффективно инициировать синтез РНК, содержащих генетическую информацию вируса гриппа. Правда, экспрессия носит обычно временный характер и ограничена цитопатическим эффектом. С другой стороны, интеграция НА-гена вместе с селективным маркером (таким, как клеточный ген тимидинкиназы) приводит к стабильной экспрессии [20]. [c.469]

Для секвенирования крупных фрагментов ДНК (примерно 2000 п. н.) используют другие стратегии. Одна из них состоит в следующем. Встраивают этот фрагмент в соответствующий плазмидный вектор и строят его подробную рестрикционную карту. Идентифицируют перекрывающиеся фрагменты вставки длиной от 100 до 500 п. н., субклонируют каждый из них в ДНК М13, секвенируют и воссоздают нуклеотидную последовательность всего исходного фрагмента. Чтобы быть уверенным в правильности полученного результата и идентификации какого-либо нуклеотида, необходимо секвенировать обе цепи по нескольку раз. Секвенирование обеих цепей облегчается тем, что каждый из субкло-нированных фрагментов исходной ДНК может быть встроен в ДНК М13 в противоположных [c.92]

В настоящее время известно. множество векторов, содержащих промоторы для РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ в комбинации с различными последовательностями. Данные о наиболее распространенных плазмидных векторах приведены на рис. 1.2. Выбор вектора — это в известной мере дело вкуса исследователя, хотя при этом могут учитываться и некоторые другие факторы. [c.16]

Методами генной инженерии удается объединить в одном геноме антигены многих вирусов, например, гриппа и бешенства, герпеса и гепатита В. Клетки, зараженные одним вирусом, приобретают временный иммунитет к заражению другим вирусом - такое явление называется интерференцией. Это сложный процесс, определяемый многими факторами, в том числе и синтезом в клетке специального белка - интерферона. До сих пор интерфероны выделяли из крови животных или из донорской крови, что являлось сложным и дорогим методом. Генноинженерный способ получения интерферона (выделение его гена и клонирование в плазмидных векторах) позволил практически решить проблему достаточного обеспечения интерфероном больных гриппом даже во время эпидемий. [c.62]

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. соИ Rfi 5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е. соИ. ol El реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. соИ. [c.118]

Плазмида — основа плазмидного вектора — кольцевая двухцепочечная ДНК, обладающая способностью к автономной репликации, а также к встраиванию в нее и передачи в геном реципиента чужеродных генов и других последовательностей ДНК. [c.464]

Вы провели клонирование сегмента (4000 п. н.) интересующего вас гена в плазмидном векторе (рис. 5-41) и теперь хотите получить карту рестрикции этого гена, чтобы перейти затем к другим манипуляциям с ДНК. Ваш руководитель оставил вам инструкции относительно того, как все это нужно сделать, и отправился в отпуск, так что вы можете полагаться только на себя. [c.44]

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отнощении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х . Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации Е. соИ, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Х , получили функциональный интерлейкин-2. [c.126]

Существует много способов выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Приводимая нами методика проста и вполне воспроизводима, но ее почти всегда можно заменить на другую. Мы описываем процедуру наработки космид Лориста — производных фага Я. Для других космидных векторов при необходимости можно ввести небольшие модификации. [c.60]

В основе метода лежит использование двух векторов — одного космидного, а другого плазмидного, не имеющих областей взаимной гомологии и различающихся по маркерам лекарственной устойчивости, например, Кт и Ар Оба вектора способны временно поддерживаться в гес+-окружении в штаммах для упаковки in vivo (разд. 2.2.8.5), причем клетки содержат обе эписомы. [c.62]

В специальную группу можно также выделить нуклеотидные последовательности ранних и других районов аденовирусов, папова-вирусов и герпесвирусов, которые клонированы в составе различных плазмидных векторов и обладают трансформирующим действием. Эти гены способны заменять по своему функциональному действию онкогены как ядерного , так и неядерного типа при тестировании их трансформирующей способности по комплементации с клеточными онкогенами при котрансформации нормальных клеток. [c.226]

Для клонирования пео-содержащих провирусов предложены две упрощенные методики каждая из них предполагает селекцию искомого клона в клетках . oli на устойчивость к канами-цину. Одна из методик представляет собой модифицированную процедуру спасения маркера и предусматривает прямое клонирование провируса в плазмидном векторе. Другая методика, гораздо более эффективная, требует применения специальных ретровирусных челночных векторов, описанных в разд. 9.3.2.4. [c.300]

В качестве плазмидных векторов для доставки транспозонов используют температурочувствительные по репликации мутанты плазмид. Клетки, получившие такую плазмиду, содержащую транспозон, высевают на селективную среду и культивируют при повышенной температуре. В этих условиях плазмида элиминируется и устойчивость к антибиотику может возникать в результате перемещения транспозона в хромосому. Другой способ избавления от плазмидного вектора связан с использованием реципиента, несущего плазмиду той же группы несовместимости. В условиях, исключающих утрату клетками резидентной плазмиды, ведут отбор трансконъюгантов по признаку, детерминируемому транспозоном. Их появление может быть обусловлено перемещением Тп-элемента в хромосому бактерии. [c.111]

Помимо секвенирования вставок в плазмидных векторах таковое возможно и с другими векторными системами, и в литературе сообщается о быстрых и простых способах выделениях ДНК фага лямбда, пригодной для ее непосредственного двуцепочечного секвенирования ферментативным методом с использованием в качестве затравок стандартных олигонуклеотидных праймеров [Manfioletti, S hneider, 1988 Malik et al., 1990]. [c.56]

Это чуть ниже температуры плавления самой легкоплавкой области во фрагменте ДНК- Двухцепочечная молекула ДНК входит в гель и продвигается в нем со скоростью, пропорциональной ее молекулярной массе. Как только фрагмент достигает участка геля, в котором температура камеры и концентрация денатурирующих веществ создают условия для плавления первой, самой легкоплавкой области (домена), он как бы разветвляется одна часть его остается двухцепочечной, а другая переходит в одноцепочечную форму. Такая разветвленная структура застревает в порах геля, в результате чего ее подвижность снижается. Снижение электрофоретической подвижности молекулы коррелирует с соотношением длин денатурированного и двухцепочечного участков чем длиннее самый легкоплавкий домен, тем сильнее снижается подвижность. Участок геля, в котором молекула ДНК начинает терять скорость, соответствует самым легкоплавким доменам. Если концентрации денатурирующих веществ подобраны правильно, то два фрагмента ДНК, различающиеся лишь одной нуклеотидной заменой и имеющие неодинаковые значения Гт, начнут снижать скорость в различных участках геля, и к концу прохождения через него их легко будет разделить. Ранее считалось, что отделить мутировавшие фрагменты от фрагмента ДНК дикого типа за счет разной степени снижения их подвижности в ДГГЭ можно лишь в том случае, если замены произошли в области с самым низким значением Гт. Однако анализ большого числа образцов ДНК, а также последующие теоретические выкладки показали, что в большинстве случаев метод ДГГЭ дает возможность обнаружить нуклеотидные замены во всех областях плавления, за исключением самых термостабильных [18, 19]. Замены в областях с самой высокой температурой плавления обычно не обнаруживаются, так как по окончании плавления последнего домена ДНК полностью денатурирует, а это приводит к нарушению корреляции между конформацией молекулы и скоростью ее продвижения. Важно помнить, что успех при проведении ДГГЭ с целью разделения мутировавшего фрагмента и фрагмента ДНК дикого типа определяется структурой фрагмента. Она должна быть разветвленной, причем мутации должны приходиться на области, подвергшиеся плавлению. Для увеличения разрешающей способности метода к исследуемому фрагменту ДНК пришивали последовательность с более высокой температурой плавления ДНК, так называемый ОС-зажим . При этом все области плавления фрагмента, включая самую тугоплавкую, становились доступными для анализа [18, 19]. Эти опыты проводили с препаратами ДНК, клонированными в плазмидном векторе, содержащем ОС-зажим . Чтобы избежать стадии клонирования, фрагменты с зажимами можно получить в полимеразной цепной реакции (см. разд. 2.3). [c.131]

Основные методы рекомбинантных ДНК, необходимые для инсерции генов -в трансформирующие векторы растений, не отличаются от таковых, используемых в работе с малыми плазмидами любого другого типа, реплицирующимися в Е. соИ. Рестрикционный фрагмент ДНК, несущий нужный ген, с помощью ли-гирования встраивают либо в промежуточный вектор (используемый для образования коинтегранта с Ti-плазмидным вектором г йс-типа), либо в бинарный вектор, а затем трансформируют подходящий хозяйский штамм Е. соИ с помощью стандартных методик. [c.35]

Плазмида pBR322 оказалась настолько хорошим клонирующим вектором, что в течение ряда лет она использовалась в подавляющем большинстве генно-инженерных работ, в которых применялись плазмидные векторы. Кроме того, на основе плазмиды pBR322 получены другие векторные производные. [c.90]

Смотреть страницы где упоминается термин Другие плазмидные векторы: [c.60] [c.236] [c.58] [c.62] [c.77] [c.397] [c.72] [c.72] [c.84] [c.96] [c.70] [c.73] [c.200] [c.237] [c.238] [c.369] [c.403] [c.230] [c.254] [c.17] [c.31] [c.210] [c.212] [c.216] [c.219] [c.239] [c.93]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология