ДСН—ПААГ маркеры

Рис. 16. Электрофорез нативного белка в градиенте пористости ПААГ. 1-анализируемый белок, 2- маркеры

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

Рис. 14. Разделение бежа в ПААГ по Лэммли. М-маркеры, 1 -4 - анализируемые белки.

РИС. 1.1. Градуировочный график для градиентного (4—30%) ПААГ, построенный с использованием в качестве белков-маркеров тироглобулина, феррити-на, каталазы, лактатдегидрогеназы и бычьего сывороточного альбумина [101]. [c.20]

Проведите разделение белковых экстрактов с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ. При необходимости проведите электрофорез окрашенных маркеров молекулярной массы (BRL). [c.188]

Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных белков по заряду в первом направлении использовал ступенчатый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с pH 4,6 — в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с pH 6,5 —в формирующем). Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуществлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения с маркерами во втором направлении) и оценены их количественные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени крысы. [c.80]

Время электрофореза зависит от предполагаемого размера защищенны от РНКазы фрагментов. В качестве грубого маркера для определени времени электрофореза используют краситель бромфеноловый сини который в 6%-ном ПААГ движется как фраг.мент размером. примерн 40 оснований, и ксилолцианол, соответствующий фрагменту примерн в 120 оснований. [c.32]

Разделение улучшается в случае малых исходных количеств белка (1—5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции около 15 см. При определении молекулярной массы, неизвестного белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соответствующего набора стандартных маркеров. Затем следует поварьировать условия —и, в частности, сопоставить значения молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в гелях с различным содержанием акриламида. [c.63]

Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении проблемы камеры элюции [Mar eau et al., 1975]. ПААГ полимеризуют в цилиндре из плексигласа, закрытом внизу диализной мембраной, лежащей на пористой подложке. Над самой мембраной в цилиндр открываются отверстия двух трубочек. Одна из них используется для подкачки, вторая — для слива элюирующего буфера. ПААГ не прилипает к плексигласу, и весь столб геля может перемещаться вверх внутри цилиндра. Такое перемещение на очень малое расстояние вызывается кратковременной подкачкой буфера под гель при закрытом сливе. Так создается камера элюции она существует только то время, которое необходимо для выхода в нее очередной полосы белка. Затем открывают кран трубочки для слива буфера. Гель под действием собственного веса оседает, и камера полностью опоражнивается. Процесс повторяют либо регулярно, по заданной программе, либо при подходе к нижнему концу геля очередной окрашенной маркером белковой полосы. Перед опорожнением камеры полярность напряжения на несколько секунд сменяют на обратную, что помогает десорбции белков с мембраны. [c.117]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология