Ступенчатый электрофорез

Во втором направлении использовали обычный ступенчатый электрофорез с 12,5%-ным рабочим ПААГ в пластине толщиной [c.52]

В процессе электрофореза электрическое сопротивление геля может изменяться (чаще всего увеличивается). Причиной этого является замена более подвижных ионов буфера в геле на менее подвижные, например при ступенчатом электрофорезе [c.42]

Область с повышенной напряженностью поля можно создать в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малоподвижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход использован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5—10 раз менее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое применение в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого приема. [c.45]

Рмс, 21, Схема ступенчатого электрофореза [c.68]

Аналогичную картину ступенчатого электрофореза легко представить себе и для кислого буфера рабочего геля, В качестве слабой ( буферной ) кислоты можно использовать уксусную, а роль быстро мигрирующего иона поручить К" ". В качестве цвиттериона, поставляющего медленно мигрирующие ионы, берут р-аланин. Подбор количественного соответствия концентраций и pH дает следующую пропись для построения системы. Для получения буфера рабочего геля 4,3%-ный водный раствор уксусной кислоты титруют КОН до pH 4,3. Буфер формирующего геля готовят аналогичным титрованием 0,35%-ного раствора уксусной кислоты до pH 5,8. Буфер верхнего электрода (анода) получают из 0, )35 М водного раствора р-аланина, титруя его до pH 4,5 опять-таки уксусной кислотой. Напомним (и это следует не упускать из виду, особенно для лабильных белков), что pH буфера рабочего геля во время фракционирования в нем белков оказывается несколько иным, чем первоначальный (примерно на 0,5 выше в случае использования щелочного буфера и настолько же ниже —для кислого). [c.70]

Для препаративного фракционирования белков нередко используют систему ступенчатого электрофореза, хотя иной раз и [c.117]

Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем ( верхнего буфера в случае использования системы с вертикальным расположением геля). [c.66]

Для электрофореза можно использовать один буферный раствор определенного состава ( непрерывный буфер) либо систему из двух буферных растворов ( ступенчатый буфер). В последнем случае собственно разделению образца на компоненты предшествует стадия его концентрирования в виде узкой стартовой зоны на границе раздела буферов (ступенчатый электрофорез). Если разделение проводится в трубках с полиакриламидным гелем, образующиеся зоны имеют форму дисков. В условиях изотахофореза [50] мигрирующие вещества образуют соприкасающиеся друг с другом зоны, которые расположены между лидирующим и замыкающим электролитом. Чтобы эти зоны не соприкасались, в исходную смесь добавляют вещества- разделители (spa ers), которые по своей электрофоретической подвижности занимают промежуточное положение между двумя наиболее близкими по этому параметру компонентами смеси. Таким образом, изотахофорез в опре- [c.28]

В 1975 г. О Фаррелл опубликовал сенсационные результаты двумерного фракционирования радиоактивно меченных суммарных белков Е. oli. В первом направлении он использовал ИЭФ, а во втором — ступенчатый электрофорез в присутствии ДДС-Na с использованием градиента концентрации ПААГ. По окончании фракционирования на пластине методом авторадиографии было выявлено около 1100 пятен различных белков (рис. 14). Метод О Фаррелла получил очень широкое распространение. Разумеется, за 5 лет он претерпел ряд дальнейших модификаций, которые будут рассмотрены ниже, но сначала отметим характерные особенности оригинального метода, избегая деталей, подробно описанных автором в его первой работе [O Farrell, 1975]. [c.45]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

Этот принцип проще всего понять, отталкиваясь от проведенного в предыдущей книге подробного рассмотрения процессов ступенчатого электрофореза [Остерман, 1981]. Вспомним поведение используемых там двух сильно отличающихся по электрофоретической подвижности анионов — хлора и глицина. Хлор в ходе электрофореза отходит к аноду, и вслед за ним из катодного резервуара движется отрицательно заряженный при щелочном pH ион глицина. Значение pH задается Трис-буфе-ром. В любой ситуации, при любом pH ион глицина следует вплотную за ионом хлора. В формирующем геле при pH 6,8, когда электрофоретическая подвижность глицина мала, происходит перераспределение напряженности электрического поля таким образом, чтобы обеспечить миграцию ионов глицина с такой же скоростью, как и ионов хлора. Разрыва между ними быть не может — иначе бы не было тока. Перераспределение напряженности поля вдоль столбика геля при ступенчатом электрофорезе используется длй сужения исходной полосы сме- си белков. Существенно, что концентрация белков при этом настолько мала, что вклад их собственной ионной проводимости незначителен по сравнению с электропроводностью буфера. Белки мигрируют в электрическом поле, не зависящем от их присутствия. Ион глицина обгоняет самый быстрый из белков, и собственно фракционирование белковой смеси происходит в Трис-глициновом бу( ре с pH 8,8 — в поле неизменной напряженности. [c.75]

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок заклеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор мономеров сразу после добавления и надежного смешивания с ним раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний участок трубки, предназначенный для внесения препарата, оставался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза (см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабочего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают верхним электродным буфером. [c.23]

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na сейчас в подавляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной, Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы, ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется, всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение исходной белковой полосы можно получить просто за счет разбавления буфера, в котором вносится препарат. Больший интерес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот прием будет рассмотрен ниже. [c.65]

Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем ( верхнего буфера в случае использования системы с вертикальным расположением геля). В этом буфере пддвижность иона, мигрирующего в том же на- [c.66]

Описанные, изменения доли заряженных молекул глицина (или аланина) используются в системе ступенчатого электрофореза. Для разных ступеней используют разные буферы, содержащие, однако, в своем составе одно и то же слабое основание или слабую кислоту, обеспечивающие собственно буферный эффект в щелочной буферной системе, где удобно фракционировать кислые белки, это может быть Трис, а в кислой системе для разделения гистонов — уксусная кислота. [c.67]

Как уже упоминалось, ступенчатый электрофорез можно использовать и для разделения белков, находящихся в комплексе с ДДС-Na. Такая система была разработана Лэммли еще десять лет назад [Laemmli, 1970]. С тех пор она приобрела чрезвычайную популярность. Хотя выше и было вйсказано некоторое сомнение в том, что ее использование всегда оправдано, система заслуживает подробного описания. [c.70]

Ступенчатый электрофорез в сочетании с обработкой ДДС-Na успешно используется для пептидного анализа и сопоставления белков по пептидному составу. В 1977 г. группа авторов с участием Лэммли предложила для этой цели систему двумерного электрофореза, в которой ферментативный гидролиз белков проводят без их элюции, непосредственно в геле, после чего ведут электрофорез во втором направлении, позволяющий сопоставлять пептиды [ leveland et al., Ю77]. В первом направлении используют описанную выше систему Лэммли для разделения смеси сопоставляемых белков. После кратковременной окраски С целью обнаружения полос индивидуальных белков последние [c.72]

При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести электрофорез в простой непрерывной системе и не очень заботиться об объеме исходного препарата. Сделанное замечание находится в противоречии с цитированными выше недавними работами, где градиентный гель использовали в сочетании ео ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при таком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обусловлено определенным консерватизмом и перестраховкой . [c.74]

Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных белков по заряду в первом направлении использовал ступенчатый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с pH 4,6 — в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с pH 6,5 —в формирующем). Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуществлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения с маркерами во втором направлении) и оценены их количественные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени крысы. [c.80]

Двумерным электрофорезом часто разделяют и другие щелочные белки. Например, факторы инициации белкового синтеза из ретикулоцитов образуют много пятен при фракционировании каждого из них в первом направлении по заряду в кислой мочевине, а во втором — по размерам ступенчатым электрофорезом в системе Лэммли [Floyd et al., 1979]. [c.81]

Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавлоном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам выявить значительное число дополнительных фракций при разделении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направлениях использовалась система ступенчатого электрофореза (3,3 /о-ный ПААГ — формирующий, 15%-ный — рабочий). Полимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в первом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При этом отпадала необходимость вести электрофорез во, втором на- [c.87]

В рассматриваемой работе удалось наблюдать значительные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. oli и даже мутантов одного штамма. Было использовано и двумерное разделение. Полоски геля после электрофореза в присутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сначала в 1,5 М Трис-НС1 (pH 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После этого их переносили на вторую пластину для ступенчатого электрофореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочевины или ступенчатым электрофорезом по Лэммли. [c.84]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология