Вестерн-блоттинг

Определение NPT-11 методом вестерн-блоттинга [c.357]

Иммунный комплекс. Продукт реакции антиген-антитело, который может также содержать в своем составе компоненты системы комплемента. Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг). Метод идентификации белков и определения их свойств с использованием антител. [c.558]

Вестерн-блоттинг. Метод переноса белков на нитроцеллюлозный фильтр с последующей идентификацией интересующего исследователя белка с помощью соответствующего зонда (например, антител). Вставка. Дополнительный фрагмент ДНК, который вводят в исходную молекулу методами генной инженерии. [c.51]

Для визуализации специфического фрагмента ДНК или РНК среди тысяч других примесных молекул используется комбинация целого ряда экспериментальных приемов, которые в совокупности получили название блоттинг . На рис. 36.5 показаны схемы проведения Саузерн-блоттинга (для визуализации фрагментов ДНК), Нозерн-блоттинга (для РНК) и Вестерн-блоттинга (для белков). Первая процедура названа по имени автора методики, остальные возникли как лабораторный жаргон, но со вре- [c.43]

Например, если матрица очень стабильна, продукт накапливается в больших количествах даже без повышения уровня транскрипции. Если изучаемый ген не обладает ферментативной активностью, можно получить соответствующие антитела и выявить экспрессию гена с помощью вестерн-блоттинга либо других стандартных иммунологических методов. [c.311]

Использование вестерн-блоттинга для анализа продуктов гена позволяет относительно просто получать количественные данные. Например, установлено, что имеется прямая зависимость между уровнем экспрессии NPT-II и числом копий соответствующего гена в трансформированных клетках моркови. [c.359]

Вестерн-блоттинг Идентификация и оценка степени чистоты АГ специфичность АТ [c.29]

Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Использующиеся в литературе термины Нозерн-блоттинг и Вестерн-блоттинг относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия - в переводе северный и западный -не имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern - южный). Тем самым они как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не только физики, но и биологи. [c.65]

ДДГ, ИЭФ, двумерный ИЭФ Вестерн-блоттинг Двумерный ИЭФ [c.31]

Вестерн-блоттинг после разделения сложной смеси белков в полиакри- [c.31]

ИЭФ определяют число дуг преципитации со стандартной смесью антигенов и сравнивают с контрольной антисывороткой (рис. 2.10). Двумерный ИЭФ аналогично ИЭФ (рис. 2.7). Вестерн-блоттинг сравнивают профиль связывания исследуемой и нормальной сывороток со стандартным антигеном. Используют маркеры мол. массы для определения специфичности антител (см. гл. 6). [c.95]

Вестерн-блоттинг определяют перекрестно реагирующие антигены других бактерий с целью абсорбции (см. гл. 6). [c.95]

Определяют авидность. Высокая авидность необходима для проведения радиоиммунологического анализа в жидкой (фазе, а также для методов, где важно иметь низкий фон, в том числе для осуществления иммуногистохимических исследований клеток и тканей и Вестерн-блоттинга. Отличительное свойство антител с высокой авидностью заключается в том, что они сохраняют способность оптимально связываться с аи- [c.112]

В настоящей главе описаны методы иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза (ИЭФ) 1В агаровых и агарозных гелях, а также иммунохимическое окрашивание реплик, полученных методом Вестерн-блоттинга после электрофореза в полиакриламидном геле. [c.197]

Вестерн-блоттинг и иммунохимическое окрашивание антигенных полос [c.230]

В гл. 2. Технология конъюгации антител с ферментами (например, пероксидазой хрена, ПХ) описана в кн. 2. Существуют коммерческие препараты конъюгированных с ПХ антител к иммуноглобулинам различных видов животных (см. приложение). На рис. 6.17 приведены результаты Вестерн-блоттинга, полученные при использовании иммуноферментного метода. [c.233]

Рис. 18.11. Плазмидный вектор, содержащий кластер генов хитиназы риса и кластер генов устойчивости к гигромицину, использовавщийся для трансформации протопластов риса. Трансформацию осуществляли обработкой протопластов полиэтиленгликолем в присутствии плазмидного вектора. Затем отбирали клетки, устойчивые к гигромицину, и проводили тестирование клеток на наличие генов хитиназы с помощью гибридизации по Саузер-ну и на наличие самой хитиназы методом Вестерн-блоттинга. Далее из клеток регенерировали целые растения.

Вестерн-блоттинг (Western blotting) Перенос белковых молекул, разделенных с помощью гель-электрофореза, на твердую подложку. [c.545]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Вестерн-блоттинг—это метод иммунологического выявления электрофоретически разделенных антигенов, связанных с твердой подложкой. В качестве подложки используют нитроцеллюлозный фильтр [8]. Разделение обычно проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Такая система позволяет разделить белки по их мол. массе, что повышает ценность метода, поскольку можно получить данные [c.357]

Вестерн-блоттинг — это исключительно чувствительный аналитический метод. С его помощью в грубом белковом экстракте можно выявить до 50 нг антигена, а в более чистых препаратах и еще меньшие количества. Хотя здесь метод вестерн-блоттинга описан как альтернативный анализу in situ для выявления экспрессии NPT-II в трансформированных тканях (разд. 6.7.3), приведенные ниже методики можно оптимизировать для исследования многих других белков. Хорошим примером служит работа Джонниса с сотрудниками [29], где с помощью моноклональных антител к фитохрому изучали молекулярные механизмы участия фитохрома в фотоморфогенных ответах. [c.358]

В данном разделе метод вестерн-блоттинга используется для выявления экспрессии гена npt-II в трансформированных клетках моркови [50]. Антитела к NPT-П получали из сыворотки кролика, при этом животных иммунизировали ферментом, выделенным из Е. oli с помощью стандартных методов работы с белками (ионообменная [35] и аффинная [15] хроматография). Показано, что NPT-П выявляется в виде одной иммуно-реактивной зоны, обладающей той же электрофоретической подвижностью, что и исходный бактериальный фермент. Эти результаты позволяют сделать ряд заключений об экспрессии фермента в клетках растений трансляция мРНК гена nos-npt-II в [c.358]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения его животным. Показано, что окрашенные на белок, вырезанные и тонко измельченные по- [c.52]

Вестерн-блоттинг способствовал выявлению и видоспецифических различий в постоянных уровнях NPT-H в трансформированной ткани. Например, после неоднократных попыток не удалось иммунологически определить NPT-II методом вестерн-блоттинга в ткани листьев табака, трансформированного С58С1 (pGV3850 1103), даже в том случае, когда фермент выявлялся биохимическим методом [46]. В настоящее время причины таких различий неизвестны, однако они могут иметь важные последствия при изучении экспрессии генов в растениях и влиять на выбор модельных растительных систем. [c.359]

Метод выделения и электрофореза белков для вестерн-блоттинга аналогичен тому, который используют для определения активности NPT-II (разд. 6.7). Если необходимы количественные результаты, то в каждом образце следует определить концентрацию белка по Брэдфорду (приложение 61III]) и провести электрофорез, нанеся на каждую дорожку известное количество белка. В предварительных экспериментах с тотальными белковыми экстрактами количество белка, наносимого на гель, должно быть относительно велико — 500—1000 мкг на дорожку. Методика, приведенная здесь, начинается с того, что берут промытый полиакриламидный гель, содержащий разделенные белки. [c.361]

Фотографируют пель, используя фильтр Кодак 2Е Wratten . Чувствительность такого определения достаточно высока, чтобы обнаружить до 0,2 нг GUS это сравнимо с чувствительностью вестерн-блоттинга ). [c.373]

Названия Нозерн - и Вестерн -блоттинг возникли как игра слав. Дело в том, что фамилия исследователя, разработавшего метод переноса ДНК на нитроцеллюлозный фильтр, на русский язык переводится как Южный (Southern). Когда появился метод переноса РНК на фильтр, ему в шутку было дано как бы противоположное название — Нозерн (Северный). После разработки метода переноса белков опять пришлось вспомнить стороны света, и появилось название Вестерн (Западный). Интересно, появится ли Истерн -блоттинг, а если появится, то где — на Западе или на Востоке, [c.385]

Вестерн-блоттинг ДСН-ЭПАГ позволяет получить отдельные полосы антигенов смесн, очищенного стандартного антигена, родственных белков и т. п. [c.94]

С помощью одних и тех же антисывороток перекрестный ИЭФ позволяет выявить большее число антигенов, чем простой ИЭФ. Дополнительное преимущество — это возможность очистки антигенов. Наибольшая ценность перекрестного ИЭФ заключается в том, что он позволяет определять специфичность антител в неденатурирующих антигены условиях. В то же время электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН с последующим Вестерн-блоттингом и иммунохимиче-ским окрашиванием хотя и обладает очень высокой чувствительностью, однако позволяет обнаружить только те антигенные эпитопы, которые не изменяются после денатурации. [c.228]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

При демонстрации связывания МКА с репликой антигена необходимо быть уверенным в специфичности конъюгата. Каждое моноклональное антитело имеет определенный изотоп. Для окрашивания реплики можно применять антитела, реагирующие со всеми изотипами мышиных иммуноглобулинов, одиако такую специфичность следует подтвердить с помощью ELISA, используя для связывания с лунками паиели чистые препараты всех изотипов. Другой способ — проверить набор МКА всех изотипов с помощью Вестерн-блоттинга. [c.235]

Ни пептид S-Tag, ни 103-звенный полипептид, используемый в качестве аффинного сорбента, не обладают ферментативной активностью, однако после образования комплекса в последнем индуцируется рибонуклеазная активность. Это позволяет количественно оценивать эффективность исследуемых систем экспрессии. Однако епде большей чувствительностью и удобством в применении обладают системы, в которых S-белок ковалентно связан с флуоресцентными красителями или ферментами (например, с классической пероксидазой хрена). Такую систему можно эффективно использовать для идентификации рекомбинантного белка с помопдью вестерн-блоттинга и ее часто применяют одновременно со второй аффинной меткой. [c.130]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.65 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.43 , c.44 , c.51 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.43 , c.44 , c.51 ]

Антитела Методы Т.1 (1991) -- [ c.29 , c.230 , c.232 ]

Вирусология Методы (1988) -- [ c.142 , c.152 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология