Плавление одноцепочечных полинуклеотидов

Первый метод, известный обычно под названием гибридизация 2 , основан на следующем принципе. Если нагреть двухспиральный комплекс ДНК выше его температуры плавления и медленно охлаждать смесь полученных одноцепочечных полимеров в присутствии другого одноцепочечного полинуклеотида, наряду с восстановлением исходного комплекса происходит образование некоторого количества гибридного двухцепочечного комплекса, т. е. комплекса, в состав которого входят полинуклеотидные цепи, принадлежавшие ранее различным макромолекулам. Такой комплекс образуется тем в большей степени, чем больше в цепи добавленного полимера нуклеотидных последовательностей, [c.61]

Данное рассмотрение энтропии петель является весьма приближенным, поскольку свободно-сочлененная цепь не может считаться достаточно хорошей моделью одноцепочечных полинуклеотидов. Более строгим был бы анализ для условий б-растворителя (гл. 18), однако эксперименты по плавлению олигонуклеотидов редко выполняются в этих условиях. И все же есть основания считать, что энтропия образования петель в реальных цепях при любых условиях подчиняется соотношению, аналогичному (23.42) [c.329]

Метод плавления двойной спирали ДНК с последующим ее восстановлением из комплементарных одноцепочечных полинуклеотидных нитей нашел одно из своих наиболее интересных применений в систематике высших организмов. Основная идея, лежащая в основе такого использования, сводится к следующему чем больше одинаковых генов у двух организмов и, следовательно, чем больше у них одинаковых последовательностей оснований в ДНК-полинуклеотиде, тем ближе их родство. Следовательно, чтобы установить степень родства между организмом А и организмом В, необходимо только выделить ДНК из их клеток, нагреть ее, провести отжиг этой смеси ДНК и установить количество образовавшихся гибридных двойных спиралей, которые несут одну полинуклеотидную цепь, полученную от А, а другую — от В. Для осуществления таких экспериментов Боултон и Мак-Карти разработали простой метод определения и количественной оценки гибридных двойных спиралей ДНК. Для этой цели ДНК, экстрагированную из организма А, нагревают до 100 С и быстро охлаждают для разделения нативных молекул ДНК на отдельные полинуклеотидные цепи. Такие разделившиеся цепи добавляют к горячему раствору расплавленного агара, который затем быстро охлаждают. При затвердевании агара отдельные цепи ДНК оказываются неподвижно закрепленными в агаровом геле. Тем временем клетки организма В выращиваются в присутствии радиоактивного предшественника ДНК, такого, как ФО " или С-тимин. Радиоактивную ДНК экстрагируют затем из клеток В, разрывают механически на относительно короткие полинуклеотидные фрагменты, содержащие около 1000 нуклеотидов в длину, нагревают и быстро охлаждают для разделения двойных спиралей на отдельные цепи и затем добавляют к агару, в котором уже закреплены отдельные цепи ДНК из организма А. После этого агар нагревают до 60 °С и выдерживают при этой температуре в течение ночи. В этих условиях начинают образовываться двойные спирали, содержащие одну полинуклеотидную цепь из организма А, а другую— из организма В. Затем через агар пропускают солевой раствор, чтобы отмыть все типы В-поли-нуклеотидных цепей, не образовавших двойных спиралей с закрепленными в агаре А-полинуклеотидными цепями и, следовательно, не включившихся в агар. Определив включение радиоактивных В-цепей, устанавливают, какая доля меченой ДНК организма В может образовать двойные спирали и, следовательно, имеет одинаковые нуклеотидные последовательности с немеченой ДНК организма А. [c.183]

Активность молекул ДНК в бактериальной трансформации (гл. VH) дает возможность исследовать денатурацию двойной спирали с помощью биологического метода. Для этого раствор трансформирующей ДНК, выделенной из генетически маркированного донорного штамма D. pneumoniae, медленно нагревают до все более высокой температуры. Из такого раствора время от времени берут образцы, которые быстро охлаждают в ледяной бане. Затем эти образцы добавляют к культуре рецнпиентного штамма пневмококка, отличающегося генетически от донорного штамма, и учитывают число трансформированных клеток, получивших аллели донора. С помощью такого опыта было показано, что трансформирующая активность пневмококков при достижении точки плавления ДНК (86 °С) резко падает. В ходе таких опытов по тепловой денатурации с использованием меченной трансформирующей ДНК было показано, что потеря трансформирующей активности, наблюдаемая при плавлении ДНК, объясняется неспособностью реципиента поглощать одноцепочечные полинуклеотиды. [c.180]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология