Денатурация двойной спирали

Физико-химические свойства ДНК. Различные факторы, нарушающие водородные связи (повышение температуры выше 80 °С, изменение pH и ионной силы, действие мочевины и др.), вызывают денатурацию ДНК, т. е. изменение пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей. Двойная спираль ДНК при денатурации полностью или частично разделяется на составляющие-ее цепи. Денатурация ДНК сопровождается усилением оптического поглощения в УФ-области пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхромным эффектом. При денатурации [c.183]

Ренатурация ДНК — процесс, обратный денатурации ДНК. Плавление гомогенных молекул ДНК — явление обратимое. При медленном охлаждении раствора ДНК, подвергнутого температурной обработке, разделенные цепи ДНК объединяются снова в двойную спираль. Быстрое охлаждение раствора ДНК характеризуется весьма [c.73]

Особый белок (раскручивающий цепи) осуществляет плавление ДНК. Кроме того, особый класс белков, связывающихся с ДНК, удерживает нити ДНК разделенными. Это так называемые белки, дестабилизирующие двойную спираль. Благодаря действию всех этих белков на ДНК образуется участок локальной денатурации и две вилки , в которых в дальнейшем и происходит репликация (рис. 6.13). [c.129]

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

Рис. 151. Образование гибридных двойных спиралей ДНК—ИРНК при совместной денатурации и ренатурации. (Опыты по центрифугированию в градненте плотности s l).

На устойчивость двойной спирали в растворе влияют многочисленные факторы. Образование упорядоченных структур является экзотермическим процессом, и поэтому спирали стремятся расплавиться при повышении температуры растворов ДНК. Из числа сил, стабилизующих нативную форму, водородные связи и диполь-дипольные взаимодействия между пуриновыми и пиримидиновыми остатками, упакованными в двойную спираль [344], должны приводить к выделению тепла. В то же время следует ожидать, что гидрофобное взаимодействие будет эндотермическим. Значение гидрофобного взаимодействия иллюстрируется тенденцией водных растворов ДНК к денатурации при добавлении органических растворителей с большими неполярными остатками [345]. Как и следовало ожидать, высокая плотность заряда, обусловленная ионизованными фосфатными остатками, расположенными вдоль цепи ДНК, обусловливает неустойчивость спиральной конформации. В результате этого добавление умеренных количеств электролитов должно стабилизовать нативную форму ДНК, что и было обнаружено при добавлении таких солей, как галогениды щелочных или щелочноземельных металлов [346, 347]. Если определить температуру плавления (Г ) как температуру, при которой изменения в спектре, характеризующие денатурацию, происходят на 50%, то Т- , по-видимому, будет иметь примерно линейную зависимость от логарифма концентрации катионов щелочных металлов. В типичном случае повышается от 36 до 82° при увеличении концентрации ионов натрия с 0,0003 до 0,1 н. Увеличение концентрации соли приводит также к сужению интервала температур, в котором происходит переход спираль — клубок. В отношении стабилизации спиральной конформации особенно эффективны некоторые двухвалентные иопы, образующие специфические комплексы с фосфатными группами основной цепи ДНК (например, Mg +). Нуклеиновая кислота как бы образует стехиометрические комплексы с этими катионами, причем Тт таких комплексов высока даже при очень слабой ионной силе. При всех условиях переход спираль — клубок происходит в удивительно узком температурном интервале, причем 90% изменений, как правило, происходит в интервале менее 10°. [c.127]

При нагревании, изменении pH и т. д. происходит денатурация ДНК— переход двойная спираль— два клубка (см. 8.4). [c.498]

Способность к денатурации. Все внешние факторы, которые приводят к ослаблению или нарушению водородных связей или стэкинг-взаимодействий, вызывают денатурацию нуклеиновых кислот. При этом происходит нарушение вторичной и третичной структуры нуклеиновых кислот, но сохраняется первичная структура молекул (рис. 8.13). Факторы, вызывающие денатурацию нуклеиновых кислот, абсолютно те же, что и факторы, приводящие к денатурации белков, но интенсивность денатурирующего действия конкретного фактора в случае нуклеиновых кислот может быть иной. При денатурации ДНК ее двойная спираль полностью или частично разделяется (раскручивается) на составляющие цепи. [c.282]

Очевидно, что судьба двойной спирали зависит от соотнощения АР и АР. Если АР < АР и О, то возможна редупликация. Если АР <. АР м АР О, то происходит денатурация. Если АР = АР О, то оба процесса равновероятны, и, наконец, при АР > О, АР > О двойная спираль остается без изменений. [c.539]

Если оставшийся нерасплетенным двухцепочечный фрагмент ДНК, состоящий из десятка или большего числа комплементарных нуклеотидов, все еще продолжает удерживать цепи от полного расхождения, то процесс денатурации может быть легко обращен. Это значит, что при приведении температуры и величины pH вновь к физиологическим значениям расплетенные участки двух цепей самопроизвольно сплетутся, образуя исходный дуплекс (отжиг, рис. 27-14). Однако если расхождение цепей полностью завершено, то ренатурация будет происходить в два этапа. Первый из них протекает сравнительно медленно, поскольку две цепи должны отыскать друг друга в ходе случайных столкновений и образовать короткие комплементарные участки двойной спирали. Второй этап осуществляется гораздо быстрее, так как остальные основания последовательно состыковываются и образуют пары комплементарных оснований. Затем две цепи застегиваются наподобие молнии, вновь образуя двойную спираль. [c.865]

Все основания, таким образом, спарены вдоль всей спирали. Следовательно, цепи должны быть комплементарны. Они идут в противоположных направлениях последовательность атомов основной цепи одна — в первой и противоположна — во второй. При нагревании происходит денатурация двойной спирали. Водородные связи между цепями разрушаются, и обе цепи образуют отдельные нити. При охлаждении спираль частично восстанавливается. [c.403]

С) высокой вязкостью. Если такой раствор нагреть до температуры выше 80-90°С или довести его pH до экстремальных значений, то вязкость раствора резко упадет, что указывает на изменение физического состояния ДНК. Мы уже видели, что высокая температура и экстремальные значения pH приводят к денатурации, или раскручиванию глобулярных белков (разд. 6.12). Точно так же высокие температуры и экстремальные значения pH вызывают денатурацию, или расплетание, двухцепочечных спиралей ДНК, разрушая водородные связи между спаренными основаниями и гидрофобные взаимодействия, с помощью которых удерживались вместе уложенные в стопку основания. В результате двойная спираль расплетается с образованием хаотических, беспорядочных одноцепочечных клубков до тех пор, пока обе цепи, наконец, не разделятся полностью. При денатурации (ее называют также плавлением) ковалентные связи в остове молекулы не разрываются (рис. 27-14). [c.865]

Денатурация нуклеиновых кислот сводится к разрушению двойной спирали (ДНК) илп двуспиральных участков (РНК). Нагревание раствора нативной ДНК вызывает разделение двойной спиралп па две цени, сворачивающиеся в статистические клубки, Нри этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность поглощения в области 260 нлг. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей N, в градиенте плотности s l (ср. с. 82). Клетки Е. сой, выращенные в среде, содержащей i, переносились в среду с обычным N. При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N, другая — N. До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см отвечающий двойным спиралям N — N. После денатурации появляются два пика — 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие одноиптчатым клубкам соответственно с и., с 4, Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль. М. м. ДНК уменьшается при денатурации вдвое. Образование клубков наблюдается в электронном микроскопе. [c.233]

Значения теплот плавления ДНК и комплексов поли Л-(-+ поли У в нейтральной среде, оцененные калориметрическим путем, близки к оценкам, полученным в работах [1 .15.19] из экспериментальных данных по зависимости температуры денатурации ДНК от pH раствора (см. 31). Отметим, что большие ( 10 ккал моль) значения теплот денатурации ДНК. по-видимому, являются дополнительным указанием на то обстоятельство, что стабильность двойных спиралей ДНК определяется не только водородными связями, но и дополнительными силами притяжения гидрофобных групп. [c.371]

Гейдушек [350] показал, что обращение процесса тепловой денатурации протекает очень быстро, если две цепи отделены друг от друга неполностью. При этом возможна также перегруппировка двойных спиралей в системы, содержащие совершенно разные образцы ДНК. Возможность быстрой и полной ренатурации денатурированной метанолом ДНК [c.128]

Прежде чем переходить ко второму методу измерения молекулярной гетерогенности, рассмотрим, что происходит с двойными спиралями ДНК при денатурации. Ясно, что они должны распасться на две отдельные нити, которые образуют более или менее беспорядочные клубки. Этот опыт является одним из самых прямых доказательств биспиральной структуры ДНК. [c.260]

Денатурация ДНК — полный или частичный разрыв водородных связей между парами азотистых оснований, ведущий к раскручиванию полинуклеотидных цепей ДНК и их последующему разделению. Процесс денатурации обычно осуществляют путем нагревания растворов ДНК или же обработкой химическими реагентами. Жесткая двойная спираль ДНК после полной денатурации дает две значительно более гибкие молекулы, быстро свертывающиеся в беспорядочные клубки. Температуру, при которой отмечается середина структурного перехода спираль — клубок, называют т емпературой плавления. Ее рассматривают как температуру фазового перехода. Этот переход сопровождается изменениями всех основных молекулярных параметров ДНК. [c.49]

Важнейшей особенностью внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих макромолекулярную структуру ДНК, является их кооперативность. Для двойных спиралей, построенных из комплементарных гомополинуклеотидов, это означает, что при их денатурации, происходящей, например, при повышении температуры и приводящей к образованию изолированных полинуклеотидных цепей, все звенья спиральной структуры разрушаются одновременно. Такой процесс называют плавлением двойной спирали. Его описывают кривой плавления, которая, в свою очередь, характеризуется мпературой плавления Тт и шириной температурного интервала, в котором происходит разрушение двойной спирали (рис. 16). [c.29]

Сообщение о денатурации и разделении цепей ДНК при повышенных температурах не вызвало большого удивления после того, как Уотсон и Крик предложили свою модель структуры ДНК. Зато открытие, сделанное в 1960 г. Мармуром, который показал, что двойная спираль может быть реконструирована из отдельных комплементарных полинуклеотидных цепей в растворе, было довольно неожиданным. Результаты одного из экспериментов Мармура приведены на фиг. 85. Слева на этом графике показана кинетика инактивации трансформирующей активности ДНК пневмококка при 100 °С. Как можно видеть, в течение 10 мин трансформирующая активность падает до уровня, составляющего менее 1% начального уровня, что происходит в результате денатурации и раскручивания молекул ДНК. Справа на этой фигуре показана трансформирующая активность образцов денатурированной ДНК, взятых через различные промежутки времени в течение 80-минутного периода, во время которого водяную баню медленно охлаждали от 100 до 60 °С. Видно, что во время охлаждения происходит постепенное восстановление активности, т. е. ренатурация двухцепочечных молекул ДНК, продолжающаяся до тех пор, пока уровень активности не достигнет 15% первоначального. [c.180]

Кинетические процессы, соответствующие конформационным изменениям в нуклеиновых кислотах, характеризуются широким диапазоном времен релаксации. Образование изолированных пар оснований и стэкинга оснований происходит за время порядка наносекунд. Короткие двойные спирали могут образовываться с константой скорости около 10 М с При этом быстро образуется неустойчивый зародыш спирали, а лимитирующей стадией является, по-видимому, образование второй или третьей пары затем происходит быстрый рост спирали. Кинетика денатурации коротких спиралей оказывается очень быстрой и характеризуется высокой энергией активации. Напротив, кинетика плавления ДНК очень сложна и может быть очень медленной. Это связано с расплетанием частично денатурированной двойной спирали, которое лимитируется трением. [c.380]

Нагревание раствора нативной ДНК при некоторых значениях pH и ионной силы вызывает разделение двойной спирали на две цепи, сворачивающиеся в статистические клубки. При этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность полосы поглощения в области 2600 А (см. стр. 498) [75]. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей в градиенте плотности СзС (см. стр. 153). Клетки Е. соН, выращенные в среде, содержащей переносились в среду с обычным При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N , другая — До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см , отвечающий двойным спиралям —N . После денатурации появляются два пика, а именно 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие однонитевым клубкам соответственно с и Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль [76]. Прямые определения молекулярного веса ДНК показывают, что при денатурации он уменьшается вдвое [75, 77]. Образование клубков при денатурации непосредственно наблюдается в электронном микроскопе (рис. 8.15). [c.507]

Что касается низкой гетерогенности бактериальных ДНК по составу (но не обязательно по последовательности), то она очевидна также из данных по определению плотности ДНК методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности [245, 246[. При изучении большого числа дезоксирибонуклеиновых кислот вновь была найдена линейная зависимость между плотностью ДНК и содержанием гуанина и цитозина. Экстраполирование этих результатов показало, что двойная спираль из аденин-тиминового полидезокси-нуклеотида должна иметь плотность 1,662, а плотность соответствующего гуанин-цитозинового полимера должна быть 1,764. Если известна плотность нативной ДНК и ее величина укладывается между этими крайними значениями, то это позволяет точно определять состав ДНК. Соответствующие денатурированные ДНК имеют плотность на 0,015 выше. Если гетерогенность двух препаратов ДНК из животных тканей удалось выявить по увеличению ширины полос, то бактериальные нуклеиновые кислоты характеризуются узким распределением по составу (половина ширины полосы соответствует 3—5 мол. % гуанина + цитозина по сравнению с 11 % для ДНК из зобной железы теленка), а распределение по составу ДНК бактериофага настолько узко, что его не удалось измерить. Избирательная тепловая денатурация ДНК из зобной железы теленка (с низким содержанием гуанин-цитозиновых пар) дает фракцию нативного препарата с более высокой плотностью, чем плотность исходного препарата, из которого она была выделена [245[. [c.577]

По последним данным Доти, гипохромный эффект в рибосомной РНК при обычных условиях (т. е. когда концентрация ионов Mg достаточно велика и превьппает 10 М) указывает на то, что значительная часть оснований находится в регулярных спиральных участках. Образование двойных спиралей РНК на первый взгляд кажется страннъш. Возможно, что наиболее правдоподобна модель Доти—Фреско, спираль Крика—Уотсона с небольшими петлями, нарушающими регулярную структуру в тех точках, где нет совпадения нужных комплементарных пуриновых и пиримидиновых оснований. В ряде отношений РНК отличается от ДНК по своему поведению в растворах и, следовательно, по своей вторичной и третичной структуре. В ДНК очень слабы поли-электролптпые эффекты, так как это очень прочная спираль и очень жесткая двойная цепь. Соответственно нативная ДНК очень сильно повышает вязкость, а при тепловой денатурации, когда двойная спираль разрушается, вязкость сильно падает. [c.282]

Суперспирализация ДНК может иметь два последствия. Если ДНК остается свободной, ее движения не сдерживаются и отрицательные супервитки вызывают напряжение скручивания, которое может быть снято раскручиванием двойной спирали, как это описано в гл. 2. ДНК может находиться в динамическом равновесии ме- ду состояниями напряжения и раскручивания (см. гл. 32). Однако суперспирализация может сдерживаться, если белки связываются с ДНК и поддерживают ее в определенной трехмерной конфигурации. В этом случае супервитки будут представлены по ходу ДНК, связанной с белками. Энергия взаимодействия между белками и су-перскрученной ДНК влияет на стабильность двойной спирали. Например, если отрицательно суперспирализованная ДНК связывается с белком, относительно специфичным к одноцепочечной ДНК, в области связывания может перманентно происходить локальная денатурация ДНК. С другой стороны, связывание гистоновых белков с образованием нуклеосом стабилизирует двойную спираль отрицательно суперспирализованной ДНК (гл. 29). [c.349]

Молекулы ДНК в клетке суперспирализованы (рис. 6.12), т. е. двойная спираль образует витки более высокого порядка — так называемые супервитки. Необходимая предпосылка репликации — раскручивание суперспирализованной ДНК, разделение и удержание комплементарных цепей в расправленном состоянии, т. е. локальная денатурация или плавление ДНК. [c.128]

Ключ к пониманию всех этих удивительных особенностей кинетики дают физические процессы, которые происходят при денатурации ДНК. Большая часть зародышей денатурированных областей образуется в середине молекулы ДНК, поскольку вероятность расположения АТ-обогашенных участков именно на концах цепей мала. Для роста зародышей необходимо раскрытие пар оснований. Поскольку ДНК является двойной спиралью, раскрытие может происходить, только если один конец растушей петли врашается относительно другого (рис. 23.18). Такое врашение, сопровождающее расплетание, должно происходить вокруг оси спирали. В начальные моменты времени (или при малых степенях денатурации) врашение осуществляется сравнительно легко. Этот процесс зависит от выигрыша свободной энергии АС при выплавлении пары. Ему препятствует трение, но оно довольно мало для длинной палочки, вращающейся вокруг своей продольной оси. По оценкам, начальная скорость вращения достигает 10 оборотов в минуту. Однако по мере плавления вместо довольно обтекаемой спирали появляются объемистые клубкообразные области. Трение при вращении этих областей значительно больше и скорость расплетания ДНК уменьшается. Увеличение трения приводит к тому, что раскручивание цепей становится лимитирующей стадией для оставшейся части процесса плавления. В результате скорость денатурации падает, приближаясь к конечному значению А , которое соответствует плавлению последней небольшой доли пар оснований. Уменьшение при увеличении конечной степени денатурации можно объяснить тем, что при этом возникает все больще клубкообразных областей большего размера. Те же соображения объясняют и заметное уменьшение при увеличении молекулярной массы. Одним из доказательств. [c.346]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология