Реакция транскрипции

В случае бактериальной РНК-полимеразы можно попытаться определить роль индивидуальных полипептидов, функционирующих на разных стадиях транскрипции. Эукариотический фермент очищен значительно хуже, и основная трудность заключается в выделении истинной РНК-полимеразной активности из неочищенного экстракта. В последующих главах мы подробно разберем все факторы, участвующие в реакции транскрипции РНК с ДНК-матрицы. [c.133]

Мы использовали 20 мкг рекомбинантной космиды для одной реакции транскрипции (это эквивалентно 2 мкг маленького вектора семейства риС). Если нужно расщепить матрицу для получения терминирующих Сайтов, рестриктируйте ее соответствующим ферментом и затем обработайте ДНК один раз фенолом и один раз хлороформом. Осадите ДНК изопропанолом, промойте 70%-яым этанолом, высушите и ресуспендируйте в ТЭ. Если нужна неочищенная ДНК, то ее можно использовать сразу. [c.66]

Реакцию транскрипции проведите, как описано в табл. 2.11. [c.66]

В реакционную смесь добавляли меченные радиоактивными изотопами субстраты РНК-полимеразы и исследовали образовавшуюся РНК в опытах по молекулярной гибридизации. Оказалось, что такая синтетическая РНК образует гибридные двойные спирали при совместном отжиге с РФ-ДНК- Она, однако, не образует таких гибридов с плюс -цепью ДНК, выделенной из зрелых частиц фага 0X174. Из этого следует, что РНК-полимераза в реакционной смеси не только образует цепь РНК, комплементарную добавленной к ферменту ДНК, но даже выбирает в качестве матрицы из двух комплементарных цепей РФ-ДНК именно мипус -цепь — ту самую цепь, которая только и активна в реакции транскрипции in vivo. [c.401]

После обработки рестриктазон мы выделяем чистую ДНК путем депротеинизации фенолом, хлороформом, осал<даем ее этанолом или изопропанолом, промываем 70%-ным этанолом и, наконец, ресуспендируем ДНК в растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1 (pH 7,4) и 1 мМ ЭДТА (ТЭ). Эти общие процедуры, ссылки на которые несколько раз встречаются в этой и следующей главе, приведены в табл. 1.1. Препараты многих рестриктаз загрязнены примесью РНКазы и поэтому использовать их надо с большой осторожностью. В реакции транскрипции конечная концентрация ДНК должна составлять примерно 20— 40 мкг/мл, поэтому для удобства ее следует растворять в ТЭ до конечной концентрации, превышающей 200 мкг/мл. [c.20]

Реакция транскрипции, катализируемая полимеразами 5Р6 и Т7, чувствительна к концентрации рнбонуклеозидтрифосфа-тов. При низких концентрациях полимеразная реакция имеет тенденцию к преждевременной терминации и образованию неполных транскриптов. Полноразмерные транскрипты обычно образуются, когда концентрация нуклеотидов превышает 250 мкМ. В принципе при получении радиоактивных зондов стремятся к получению максимальной удельной радиоактивности путем увеличения удельной радиоактивности нуклеозидтри-фосфата-предшественника. В то же время очевидно, что при работе с нуклеозидтрифосфатами в концентрации 250 мкм нереально использовать меченые предшественники с высокой [c.21]

В реакции транскрипции могут использоваться радиоактивные нуклеотиды, меченные Р, или Н. Изотоп Р дает такой радиоактивный сигнал, который не удается локализовать на уровне отдельной клетки, но который легко можно обнаружить с помощью радиоавтографии всего за несколько дней. Следует иметь в виду, что излучение невозможно достаточно эффективно регистрировать с помощью стандартной эмульсии гораздо лучше это делать, экспонируя меченый препарат с рентгеновской пленкой (Д. Дэвидсон, личное сообщение Р. Купмен, личное сообщение). Излучение имеет гораздо меньшую энергию, чем излучение Р поэтому оно обеспечивает лучшее разрешение, и, кроме того, меченные этим изотопом нуклеотиды имеют более высокую удельную радиоактивность, чем нуклеотиды, меченные тритием. Рибонуклеозидтрифосфаты, меченные довольно эффективно включаются в РНК под действием полимераз фагов SP6 или Т7. [c.35]

Реакции транскрипции наиболее эффективно проводят на ДНК-матрицах, очищенных в s l (разд. 2.2.9.3). Важно тщательно очистить ДНК с помощью следующей процедуры, удобной в работе и не требующей много усилий [c.65]

На основании экспериментов с ts-мутантами, дефектными по синтезу РНК, предположили, что РВ1 и РВ2 вовлечены в синтез мРНК, а РА — в синтез вРНК [130, 195, 239]. Дальнейший анализ реакции транскрипции in vitro показал, что белок РВ2 вовлечен в связывание кэп-структуры хозяйской первичной РНК [26, 198, [c.43]

Вторая стадия реакции — инициация транскрипции посредством включения Г-остатка на З -конце фрагмента кэппированного праймера, вырабатываемого эндонуклеазой (см. рис. И). Этот промежуточный этап в реакции транскрипции может быть определен инкубированием немеченого РНК-праймера с комплексом вирионной транскриптазы в присутствии (а-З Р)-ГТФ как единственного рибонуклеозидтрифосфата [77]. Из фрагментов праймера, вырабатываемых эндонуклеазой, те, которые содержали З -терми- [c.69]

Б этом разделе описывается синтез РНК-зондов пзггем транскрипции in vitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор [37, 38]. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК (10 Ки/ммоль на один меченый NTP). Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК- Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед (а не 1—2 дня, как зонды с высокой удельной активностью). Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью (200—400 Ки/ммоль по одному из NTP). Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40—80 мкКи меченого NTP. [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология