Активность полимеразная

Рис. 20.20. Концевое мечение двухценочечных ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4. З -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы катализирует отщепление 3 -концевых нуклеотидов фрагментов ДНК с тупыми концами (А), с выступающими З -концами (F) или с выступающими 5 -концами (В). Отщепление происходит до тех пор, пока на противоположной цепи не экспонируется основание, комплементарное меченому дезокси-рибонуклеотиду, введенному в реакционную смесь (dGTP ) затем включается полимеразная активность ДНК-полимеразы Е4, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый дезоксирибонуклеотид. Метка включается в оба конца фрагментов ДНК (на рисунке это не показано). Для мечения можно использовать любой дезоксирибонуклеотид.

ДНК-полимераза I — полипептид с. VI около 120 ООО, обладающий полимеразной и З -экзонуклеазной активностями. Его содержание в бактериальной клетке в несколько раз ннже чем ДНК- [c.48]

Известно, что ДНК-полимераза некоторых микроорганизмов устойчива к действию радиации. При облучении одного из видов плесени дозой 100000 р не удалось обнаружить снижения полимеразной активности [35]. Необычно высокая устойчивость полимеразы в этом случае может быть связана с существованием у микроорганизмов некоторого запаса фермента, который сам по себе устойчив к радиации. В клетках млекопитающих ДНК-полимераза синтезируется через более короткие промежутки времени и основную роль играет радиочувствительность процесса синтеза фермента. [c.124]

К настоящему времени в этом направлении накоплен значительный экспериментальный материал. По данным многих исследователей, затравочная активность ДНК в ДНК- и РНК-полимеразных системах заметно угнетается при облучении в относительно низких дозах — порядка 1000 и даже 500 р. Рентгеновское облучение препаратов ДНК дозой 5000 рад снижает их матричную способность в РНК-полимеразной системе до 30% от контроля. Физико-химический анализ макромолекул, используемых в качестве затравки, показал, что облучение этой дозой приводит к уменьшению молекулярного веса ДНК в результате деполимеризации (до 60%), к снижению температуры плавления двуспиральной структуры с 75 до 67° и повреждению 0,2% оснований. Более резкое падение затравочной активности ДНК по сравнению с ее молекулярным весом, свидетельствует, по-видимому, о том, что радиационная инактивация матрицы обусловлена совокупностью всех этих нарушений структуры. [c.186]

По литературным данным, аналогичное снижение матричной активности ДНК в РНК-полимеразной системе достигается в результате химического видоизменения затравки при ее предварительной обработке мутагенным (гидроксиламин) или канцерогенным (2-амино-1-нафтол) соединениями. [c.186]

В клетках эукариотических организмов обнаружены четыре ДНК-полимеразы а, р, V и 6. ДН К-полимераза а считается основным ферментом ядерной репликации. Содержание этого фермента заметно возрастает во время S-фазы клеточного цикла, когда происходит активный синтез ДНК- Только эта ДНК-полимераза подавляется афидиколином — ингибитором синтеза ДНК эукариот. Фермент состоит из нескольких субъединиц разного размера. Например, у дрозофилы молекулярные массы субъединиц составляют 148, 58, 46 и 42 кД. Полимеразная активность присуща самой большой из субъединиц. Молекулярная масса нативной эукариотической ДНК-полимеразы а составляет около 500 кД. Так же как в случае ДНК-полимеразы IИ . o/ , эффективность и высокая процессивность работы полимеразы а зависят до дополнительных субъединиц, которые сами по себе полимеризующей активностью не обладают. Одна из субъединиц ДНК-полимеразы а оказалась ДНК-праймазой — ферментом, необходимым для инициации новых цепей ДНК (см. ниже) ассоциация с праймазой не характерна для ДНК-полимераз бактерий. [c.50]

Как было указано, инициация биосинтеза дочерних цепей ДНК требует предварительного синтеза на матрице ДНК необычного затравочного олигорибонуклеотида, названного праймером, со свободной гидроксильной группой у С-3 рибозы. Этот короткий олигорибонуклеотид синтезируется комплементарно на матрице ДНК при участии особого фермента-праймазы, наделенной РНК-полимеразной активностью. [c.485]

В работах Фокса (1966—1968) экспериментально исследовалась самоорганизация в полипептидных цепях, образуемых при термической поликонденсации эквимолярных смесей 18 канонических аминокислот (кроме Асп и Глу) в присутствии солей фосфорной кислоты, игравших роль водоотнимающих средств. Прп этом образуются цепи неравномерного состава, синтетические полипептиды, названные Фоксом протеиноидами. Эти соединения обладают каталитической активностью, сходной с ферментативной с их помощью удалось проводить реакции гидролиза, декарбокснлнрования, амннирования и дезаминирования. Однако полимеразная активность у протеиноидов пе обнаружена. [c.537]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация - иногда в миллионы раз - осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень их 3 -гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 ООО п. п. 3) термостабильная ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше 4) четыре дезокси-рибонуклеотида. [c.94]

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадий литического цикла, поместить ген la Z Е. соН, кодирующий -галакгозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном A MNPV, то в присутствии хромогенного субстрата -галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет. [c.144]

Для концевого мечения ДНК-фрагментов -независимо от характера образующихся после эндонуклеазной обработки концов (5 -, 3 -выступающих или тупых) - можно использовать реакцию замещения, катализируемого ДНК-по-лимеразой Т4. В этом случае к препарату кос-мидной ДНК, обработанной рестриктазой, добавляют ДНК-полимеразу и один меченый дезоксинуклеотид (рис. 20.20). Под действием З -экзонуклеазной активности ДНК-полимера-зы происходит последовательное отщепление 3 -концевых нуклеотидов. Процесс продолжается до тех пор, пока в противопложной цепи не экспонируется нуклеотид, комплементарный меченому дезоксинуклеотиду, добавленному в реакционную смесь. Далее включается полимеразная активность ДНК-полимеразы, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый нуклеотид. Поскольку другие нуклеотиды в реакционной смеси отсутствуют, дальнейшего роста цепи не происходит. [c.463]

Фрагмент Кленова (Klenov fragment) Более крупный из двух фрагментов ДНК-полимеразы I Е.соИ, образующийся при ее протеолитическом расщеплении. Сохраняет полимеразную активность в направлении 5 —>3 и экзонуклеазную — в направлении 3 ->5. Используется, в частности, при секвенировании ДНК, [c.563]

Вирус ВИЧ в составе зрелой внеклеточной частицы содержит геномную молекулу РНК. Однако развитие вирусной инфекции связано с этой РНК лишь в самой начальной фазе. По информации, содержащейся в этой РНК, воспроизводится молекула ДНК, сначала однонитевая. Затем на ней, как на матрице, воспроизводится комплементарная цепь и образующаяся двунитевая ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Именно эта ДНК далее управляет синтезом копий мРНК, необходимых для программирования синтеза вирусных белков, и самой РНК вириона, которая должна входить в состав новых вирусных частиц. Исходная же РНК при синтезе ДНК постепенно уничтожается с помощью активности, известной под названием РНКазы Н. Этот фермент катализирует гидролитическое расщепление РНК в составе гибридного дуплекса РНК-ДНК. Таким образом, для формирования двунитевой ДНК копии геномной РНК вируса ВИЧ-1 необходимо проявление трех активностей обратной транскрипции для синтеза однонитевой ДНК, ДНК-полимеразной активности для получения двунитевой ДНК и, наконец, активности РНКазы Н. Оказывается, все эти активности присущи самой обратной транскриптазе вируса БИЧ-1. Однако самое удивительное состоит в том, что переключение активностей проис.ходит строго упорядоченно, это не просто три параллельно работающих активных центра на одном ферменте. Последовательность происходящих событий представлена на рис. 68. Рассмотрим ее более подробно. [c.225]

Специфичность ферментативных тестов можно значительно повысить, проводя анализ не общей ферментативной активности, а отдельных молекулярных форм или изоэнзимов. Для этого применяют такие методики, как электрофорез, ионообменную или гель-распределительную хроматографию, изоэлектри-ческое фокусирование. Еще одним методом анализа изоферментов может служить использование специфических к изоферменту антител. Этот метод обладает высокой чувствительностью и может быть легко автоматизирован. В последние годы получила распространение диагностика наследственных заболеваний при помощи рекомбинантньос ДНК и метода полимеразной цепной реакции. В этой технологии большую роль играют ферменты рестриктазы. [c.87]

Непосредственно синтез новой цепи ДНК осуществляется при помощи ДНК-полимераз. У прокариот найдено три типа этих ферментов, а именно ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III. ДНК-полимераза I — протомер с молекулярной массой около 100 kDa. Фермент полифунк-ционален он обладает полимеразной и нуклеазной активностью. Принимает участие в процессах репарации ДНК. Роль ДНК-полимеразы П пока не совсем ясна, известно, однако, что мутации генов, ее кодирующих, не сказываются на жизнеспособности клеток. Из этих ферментов ДНК-полимераза П1 оказалась наиболее функционально значимой именно этот фермент катализирует наращивание полинуклеотидной цепи ДНК. Он является олигомером и состоит из семи неравнозначных субъединиц, одна из которых обладает наибольшей полимеразной активностью. Оказалось, однако, что ДНК-полимераза III не может самостоятельно присоединяться к цепи ДНК и инициировать образование новой цепи, поэтому синтез должен быть инициирован какой-то другой структурой. Такой структурой является фрагмент РНК, который синтезируется в сайте инициации и к которому присоединяется ДНК-полимераза. Этот фрагмент называется праймером, а РНК-полимераза, катализирующая его образование, — праймазой. [c.451]

После образования фрагментов ДНК рибонуклеозидные участки удаляются при помощи специфичной рибонуклеазы или РНК-азы Н. Кроме того, в деградации праймеров принимает участие ДНК-полимераза I, обладающая как полимеразной, так и нуклеазной активностью. Этот фермент имеет два функционально значимых центра. В то время как нуклеазный центр катализирует деградацию праймера, полимеразный центр заделывает образовавшиеся бреши, достраивая дезоксирибонуклеозид-фосфатные участки. [c.452]

При мягком протеолитическом расщеплении субтилизином ДНК-полимераза 1 дает два полипептида, один из которых обладает только 5 З -зкзонуклеазной активностью, тогда как другой сохраняет полимеразную и 3 5 -экзонуклеазную активности. Последний фрагмент носит названне большого фрагмента ДНК-по-лимеразы 1 или фрагмент Кленова. [c.350]

Колонка (150X10 мм) была уравновешена стандартным буферным раствором, в котором проводилась хроматография [0,01 М трис (pH 8,0), 10- М ЭДТА, 10- М дитиоэритротиол, 5%-ный глицерин], и 0,25 М хлоридом калия. Элюирование адсорбированного белка осуществляли линейным градиентом концентрации хлорида калия (600 мл, 0,25 1,25 моль/л) в стандартном буферном растворе. 95 мл раствора РНК-полимеразы наносились на колонку. Постоянная скорость потока при загрузке колонки и элюировании поддерживалась перистальтическим насосом. Фракции по 10 мл собраны и испытаны на РНК-полимеразную активность с использованием ДНК тимуса теленка (/) и ДНК Т4 (,2) в качестве матриц. Общий выход РНК-полимеразной активности с колонки составлял 80%. Сплошная линия — оптическая плотность при 280 нм, пунктир — концентрация хлорида калия. [c.271]

Если к хроматину, обладавшему РНК-полимеразной активностью, добавляли абсцизовую кислоту (10" М), то это приводило к торможению полимеразной активности на 22—38% в том случае, когда этот ингибитор вводили в систему гомогенизированных проростков. Добавление же абсцизовой кислоты непосредственно к чистому хроматину не влияло на его активность (Pearson, Wareing, [c.198]

Эти данные Пирсон и Вэринг интерпретируют как возможность абсцизовой кислоты влиять на РНК-полимеразную активность только после связывания этого ингибитора с эндогенным цитоплазматическим фактором. [c.198]

Приведенные выше характеристики ферментов биосинтеза ТМФ в полной мере относятся и к киназам, фосфорилирующим его до трифосфата. Так, например, отмечено, что экстракт нормальной печени крысы почти не фосфорилирует ТМФ, хотя остальные дезоксимононуклеотиды фосфорилируются нормально. В то же время ТМФ быстро фосфорилируется экстрактом регенерирующей печени [23]. Установлено, что киназы, катализирующие биосинтез ТТФ из тимидина или его монофосфата, отсутствуют в нормальной, но появляются в регенерирующей печени крысы и в других тканях, характеризующихся быстрой скоростью роста. Изучение характера появления ферментативной активности киназ в зависимости от времени после гепатоэктомии показывает, что максимальный уровень их активности совпадает с началом синтеза ДНК [9, 15]. К этому моменту в регенерирующей печени сильно увеличивается активность ДНК-полимеразы — фермента заключительного этапа синтеза ДНК. Значительной ДНК-полимеразной активностью обладает тимус, эмбриональная и опухолевая ткань [14]. [c.121]

Исключительный интерес представляет также тот факт, что ДНК, облученная дозой 250000 рад, резко снижает затравочную способность нативной ДНК в РНК-полимеразной системе. Создается впечатление, что под действием энергии излучения ДНК превращается в форму, ингибирующую ферментативную активность РНК-иолимеразы. [c.186]

ДНК-зависимая ДНК-полимераза (К. Ф. 2. 7. 7. 7.) — ДНК-нуклеотидилтранс-фераза, или фермент Корнберга (ДНК-полимераза 1), осуществляющий полимеризацию дезоксирибонуклеозидтрифосфатов на ДНК-матрице в присутствий ионов Выделенный из кишечной палочки после тщательной очистки фермент представляет собой препарат, гомогенный по критериям седиментации, хроматографии и электрофореза в крахмальном геле. Наряду с полимеразной активностью фермент обладает также экзонуклеазной активностью. [c.50]

Смотреть страницы где упоминается термин Активность полимеразная: [c.302] [c.315] [c.48] [c.49] [c.50] [c.263] [c.309] [c.426] [c.501] [c.48] [c.49] [c.263] [c.309] [c.482] [c.267] [c.212] [c.178] [c.182] [c.261] [c.350] [c.350] [c.351] [c.903] [c.905] [c.1004] [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология