Экзонуклеазное действие ДНК-полимеразы

III удлиняет эти затравки до тех пор, пока не упрется в предыдущую затравку, т. е. синтезирует фрагменты Оказаки. Затем действует ДНК-полимераза I, которая продолжает удлинять фрагменты Оказаки, одновременно гидролизуя РНК-затравку предыдущего Фрагмента, используя свою 5 -экзонуклеазную активность. После действия ДНК-полимеразы I между двумя соседними фрагментами остается только одноцепочечный разрыв, который зашивает ДНК-лигаза. Таким образом, в репликативной вилке одновременно работают около 20 разных полипептидов, осуществляя сложный, высо-Коупорядоченный и энергоемкий процесс. Не говоря уже о том, что Каждый нуклеотид переходит в ДНК из богатого энергией предшественника, множество. молекул АТР тратится на действие хеликаз, на синтез РНК-затравок, которые затем удаляются, на активацию ДНК-полимеразы III при переходе на каждый новый фрагмент Оказаки запаздывающей цепи и на работу топоизомераз по Раскручиванию взаимозакрученных цепей ДНК (см. ниже). Такова цена высокой точности и скорости репликации. [c.57]

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

Рис. 2.17. Схематическое изображение ферментативного действия ДНК-полимеразы, обладающей 5 —> 3 -полимеразной активностью (А), 3 —> 5 -экзонуклеазной (редактирующей) активностью (В) и 5 —> 3 -экзонуклеазной (репарирующей) активностью (Б)

Предполагают, что 3 —5 -экзонуклеазное действие позволяет ДНК-полимеразе I играть роль как бы корректора . Эта полимераза действует на З -конце растущей цепи ДНК. Согласно предположению о роли ДНК-полимеразы I как корректора, прежде чем передвинуться в следующее положение , фермент проверяет правильность образования предыдущей пары оснований. Если предыдущая пара сформирована непра- [c.275]

Экзонуклеазное действие ДНК-полимеразы I [c.967]

З -ОН-группа концевого рибонуклеотида этой короткой цепи РНК служит затравкой для синтеза ДНК под действием ДНК-поли-меразы П1. По матрице материнской ДНК точно синтезируется комплементарная цепь дочерней ДНК в направлении 5 —> 3 (у прокариот — 1000-2000 нуклеотидов, в животных клетках — 150-200 нуклеотидов). Точность синтеза определяется тем, что фермент редактирует синтезированную цепь если ДНК-полимераза встраивает неправильный нуклеотид, то фермент сам может распознать неспособность этого нуклеотида образовать правильную пару с соответствующим нуклеотидом матричной цепи. В этом случае фермент возвращается назад и отщепляет неправильный нуклеотид с З -конца цепи за счет экзонуклеазной активности, после чего ДНК-полимераза продолжает присоединять правильные нуклеотиды в направлении 5 -> 3. В результате достигается высокая точность матричного синтеза (не более одной ошибки на 1—10 млрд нуклеотидных остатков). Аналогичный процесс происходит и на второй расплетенной цепи ДНК синтез праймера и затем дочерней цепи ДНК в направлении 5 -> 3. Поскольку цепи антипараллельны, то на первой рост цепи совпадает с направлением движения репликативной вилки, а на второй — идет в противоположном направлении. [c.303]

РИС. 15-30, Схематический рисунок, показывающий три типа ферментативной активности ДНК-полимеразы I. Верхний рисунок иллюстрирует 3 -5 -экзонуклеазиую или корректирующую активность фермента. Хотя на рисунке показано, что фермеит передвигается иа одно положение вперед до того, как произойдет следующий этап, иа самом деле момент, когда происходит передвижение, ие установлен. Нижний рисунок иллюстрирует реакцию полимеризации и 5 -3 -экзонуклеазное действие. [c.275]

Рис. 13.8. Синтез in vitro радиоактивной цепи ДНК (цветная линия) при действии ДНК-полимеразы I. Совместное действие полимеризационного и экзонуклеазного центров (см. рис. 13.7) приводит к перемещению одноцепочечного 3 -ОН/5 -РО -разрыва вокруг показанной на рисунке кольцевой матричной цепи. Поэтому данный процесс называется ник-трансляцией (т.е. перемещением разрыва).

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5 -> З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З -конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З -ОН нового фрагмента ДНК и 5 -фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамидадениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов). [c.253]

Для концевого мечения ДНК-фрагментов -независимо от характера образующихся после эндонуклеазной обработки концов (5 -, 3 -выступающих или тупых) - можно использовать реакцию замещения, катализируемого ДНК-по-лимеразой Т4. В этом случае к препарату кос-мидной ДНК, обработанной рестриктазой, добавляют ДНК-полимеразу и один меченый дезоксинуклеотид (рис. 20.20). Под действием З -экзонуклеазной активности ДНК-полимера-зы происходит последовательное отщепление 3 -концевых нуклеотидов. Процесс продолжается до тех пор, пока в противопложной цепи не экспонируется нуклеотид, комплементарный меченому дезоксинуклеотиду, добавленному в реакционную смесь. Далее включается полимеразная активность ДНК-полимеразы, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый нуклеотид. Поскольку другие нуклеотиды в реакционной смеси отсутствуют, дальнейшего роста цепи не происходит. [c.463]

ДНК-полимераза гена 43 обладает обычной 5 —З -синтетической активностью, связанной с 3 —З -экзонуклеазной корректирующей активностью (гл. 32.) Оставшиеся три белка отнесены к полимеразным вспомогательным белкам . Продукт гена 45 является димером. Продукты генов 44 и 62 образуют прочный комплекс, который характеризуется АТРазной активностью и тем, что он увеличивает скорость движения ДНК-полимеразы в 3 раза, от 250 до примерно 800 нуклеотидов/с последнее значение близко к скорости движения ДНК-полимеразы in vivo ( 1000 нуклеотидов/с). Увеличение в скорости не зависит от того, используется одно- или двухцепочечная матрица. В тех случаях, когда ДНК-полимераза фага Т4 работает на одноцепочечной матрице ДНК, скорость ее движения непостоянна. Фермент быстро передвигается в пределах одноцепочечных областей, однако при прохождении через области, имеющие вторичную структуру, образуемую спарившимися внутри цепи основаниями, движение его замедляется. Прохождению ДНК-полимеразы через такие участки способствуют вспомогательные белки. Их роль заключается в увеличении скорости репликации в трудных областях и, следовательно, в поддержании равномерности движения ДНК-полимеразы. Присутствие белков увеличивает сродство ДНК-полимеразы с ДНК, а также ее способность удерживаться на матричной молекуле без диссоциации. Возможно, что белки действуют как зажим , удерживая ДНК-полимеразную субъединицу на матрице более прочно. Для такого эффекта необходимо совместное действие всех трех белков. Подобный тип взаимоотношений оставляет открытым вопрос о том, что является компонентом ДНК-полимеразы, а что-вспомогательным фактором. [c.428]

Эукариотические ДНК-полимеразы не обладают 3 -> -> 5 -экзонуклеазной активностью и обусловливают гораздо более высокую частоту возникновения ошибок при репликации ДНК фага фХ174 in vitro. При одинаковых условиях для эукариотических полимераз наблюдались следующие частоты 3-10 для ДНК-полимеразы а (Pol а), 1,2-3,0 -10 для ДНК-полимераз Р и у- Очевидно, что для обеспечения необходимой точности репликации в эукариотических клетках должны присутствовать дополнительные ферменты, повышающие точность этого процесса. Некоторые биохимические данные свидетельствуют о наличии у эукариот фермента с 3 -> 5 -экзонуклеазной активностью, действующего в контакте с ДНК-полимеразой а. Этот фермент может обеспечивать корректорскую функцию in vivo, утрачиваемую в ходе очистки ДНК-полимеразы а. [c.122]

Как можно видеть из приведенных схем, наибольшее число консервативных участков локализовано в имеющемся у всех ферментов (что вполне естественно) домене, отвечающем за полимеразную активность. Некоторые из этих участков связываются с ДНК, а другие с дНТФ и ионами магния. Этому домену предшествует домен, выполняющий редактирующие функции в виде 3 — 5 -экзонуклеазной активности. У термостабильных ДНК-полимераз в этом домене имеется только один консервативный участок (Taq ДНК-полимераза) или они все отсутствуют (Bst ДНК-полимераза), вследствие чего оба этих фермента лишены подобной редактирующей активности. КН2-терминальный домен у ДНК-полимеразы I несет репарирующую 5 — З -экзонуклеаз-ную активность. Подобную активность проявляют обе упомянутые выше термостабильные ДНК-полимеразы, что, вероятно, объясняет обнаруженную у них некоторую гомологию этого участка с аналогичным у ДНК-полимеразы I. Что касается большинства ДНК-полимераз, модифицированных с целью их большей пригодности для ферментативного секвенирования ДНК либо ограниченным протеолизом, либо специально созданных генно-инженерным путем, то их объединяет общая черта, заключающаяся в удалении имеющейся у их предшественников 5 — 3 -экзонуклеазной активности. Путем делеции нескольких аминокислотных остатков во втором экзонуклеазном домене Т7 ДНК-полимеразы была убрана имевшаяся 3 — 5 -экзонуклеазная активность. Сайтнаправленный мутагенез двух аминокислот в экзонуклеазном домене Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I привел к удалению 3 —> 5 -экзонуклеазной активности этого фермента. Как можно представить из приведенных схем, столь разные структурные организации рассматриваемых ферментов не могли не сказаться на особенностях их ферментативного действия, чему и будет посвящено дальнейшее изложение. [c.83]

Также была предложена оригинальная стратегия получения делеционных вариантов субклонов, основанная на применении все той же экзонуклеазы III [Henikoff, 1990]. Суть этой стратегии заключается в образовании сначала двуцепочечной структуры из одноцепочечного фага М13 или ему подобного и уже затем создании делеций. Так, на первом этапе проводится отжиг олигонуклеотидного праймера, расположенного таким образом, чтобы ДНК-полимеразой при удлинении праймера в первую очередь была скопирована сама векторная последовательность. Построение цепи ДНК осуществляется с помощью ДНК-полимеразы фага Т4, поскольку этот фермент характеризуется высокой скоростью полимеризации, не несет 5 — 3 -экзонуклеазной активности и не вызывает смещение цепей как некоторые другие ДНК-полимеразы. В результате образуется двуцепочечная молекула ДНК, несущая один ник между 5 -концом праймера и 3 -концом вновь синтезированной цепи ДНК. Далее в действие вступает экзонуклеаза III, работающая в обратном направлении и расширяющая ник до весьма протяженных участков одноцепочечной ДНК. Отбор аликвот данной реакции по времени расщепления приводит к формированию некоторого пула молекул с одноцепочечными участками различной протяженности. После удаления образовавшихся одноцепочечных участков S1 нуклеазой, репарации концов и их лигирования проводится трансформация компетентных клеток E. oli полученными конструкциями. Таким образом, как можно видеть из рис. 8.12, в результате всех этих процедур об- [c.259]

N-концевой домен молекулы ДНК-полиме-разы IЕ. соН соединен со след)тощим доменом петлей из аминокислотных остатков (см. рис. 1.12), которая наиболее доступна действию протеаз. Поэтому при ограниченном протеоли-зе фермента субтилизином, трипсином или другими протеазами он распадается на два фрагмента, имеющих размер 68 кДа и 35 кДа. Меньший фрагмент обладает 5 -3 -экзонуклеазной активностью, а больший — 5 -3 -полимеразной и 3 -5 -экзонуклеазной активностями. Последний бифункциональный фрагмент принято называть фрагментам Кленова ДНК-полимера-зы IЕ. oli (по фамилии одного из описавших его авторов). Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (PolIK) можно выделить также из экстрактов Е. соИ. Происходит ли образование этого фрагмента в клетке или он формируется в процессе экстракции, пока не ясно. [c.25]

ДНК-полимераза обладает еще одним видом ферментативной активности в определенных условиях она способна расщеплять цепи ДНК. ДНК-полимераза постепенно гидролизует цепь ДНК с З -гидроксильно-го конца. При этом отщепляются мононуклеотиды. Таким образом, ДНК-полимера-за I является также 3 ->5 -экзонуклеазой (рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должен иметь свободный З -ОН-конец и не должен находиться в составе двойной спирали. Является ли такая экзонуклеазная активность фермента нежелательным побочным эффектом, или она каким-то образом участвует в биологическом действии ДНК-по-лимеразы Эксперименты с использованием химически синтезированных полинуклеотидов с некомплементарным остатком на конце затравки показали, что 3 —> — > 5 -экзонуклеазная активность выполняет в процессе полимеризации функцию редактирования. Рассмотрим полимер, показанный на рис. 24.28, в котором последовательность остатков dT образует двойную спираль с более длинным полимером dA. На З -конце этой poly(dT)-пo лeдoвaтeль-ности имеется один остаток d , который [c.24]

В обоих случаях используются реакции гидролиза 3 —>5 -экзонуклеазная активность ДПК-полимеразы I и гидролиз ошибочного промежуточного продукта аминоацил-АМР под действием аминоацил-тРПК—синтетазы. [c.357]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология