Методика 20. Электрофорез в агарозном геле

Ниже описаны некоторые общие методики и реагенты, используемые при электрофорезе нуклеиновых кислот и белков в акриламидном и агарозном гелях. Приведены также работы, из которых взяты основные детали описываемых методик. [c.376]

Идентификация конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК является более сложной задачей. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом при ультрафиолетовом облучении выглядит как более или менее равномерно окрашенная поверхность. Задача генетика — выявить специфические фрагменты ДНК. Такую задачу решают с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов (рис. 8.13). [c.263]

Для разделения нужных фрагментов ДНК проведите электрофорез в агарозном геле, используя трис-ацетатный или трис-фосфатный буфер (см. методику 20) с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. [c.130]

С помощью электрофореза в агарозном геле отделите. нужный фрагмент. Используйте трис-ацетатный буфер (методика 20), содержащий 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Слейте из аппарата столько буфера, чтобы поверхность геля оказалась выше его уровня. [c.132]

В данную главу включено подробное описание обработки ДНК рестриктазами, электрофореза в агарозном геле, а также переноса и гибридизации по Саузерну. Этот подход составляет основу многих методик, описанных в гл. 1, 3, 4 и 6. [c.277]

Используйте стандартную методику гель-электрофореза РНК [281. Удобнее всего работать с содержащими формальдегид агарозными гелями а для переноса РНК и анализа ее на фильтрах можно использовать методы, описанные в работе [28]. Мы получали хорошие результаты с найло- овыми фильтрами Hybond (Amersham International), следуя инструкциям-фирмы-производителя. [c.29]

В лаборатории Лаурелла был разработан метод электрофореза в агарозном геле для разделения белков. Подробное описание прибора и методики можно найти в работе Йоханссона [630]. Электрофорез проводят в 17о-ном геле толщиной 1 мм на охлаждаемой водой стеклянной пластинке. Для охлаждения используют пластмассовую коробку с циркулирующей в ней водой (температура не выше 15 °С). Электрический контакт между разделяющим гелем и сосудами с буфером осуществляется через агарозные мостики. Канавки в геле для внесения 3— 10 мкл пробы, содержащей 10—100 мкг белка, получают при помощи сделанного из стальной бритвы шаблона с прямоугольными зубцами. Его помещают на пластинку сразу же, как только выливают а нее теплый раствор агарозы. Градиент напряжения при электрофорезе составляет 15—20 В/ом. [c.63]

Агаровый или агарозный гель является наиболее подходящей средой для иммунодиффузии, В классическом варианте иммуноэлектрофореза и электрофорез, и иммунодиффузию осуществляют в одном и том же геле. Однако во многих случаях иммунодиффузию приходится проводить уже после того, как макромолекулы были разделены в другой среде, менее подходящей для иммунодиффузии. Паулик [1027] еще в 1852 г. применил иммунодиффузию для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза на бумаге. Хотя иммунодиффузию можно осуществлять и на ацетате целлюлозы (см. ниже), Кон [695] предложил переносить антигены с ацетата целлюлозы в агаровый гель вместо того, чтобы проводить весь иммуноэлектрофо-ретический анализ на ацетате целлюлозы. Пленку из ацетата целлюлозы, на которой антигены подвергали электрофорезу, разрезают на две половинки одну из них окрашивают, а из другой вырезают полоску шириной 1 см (на расстоянии 1 см от центральной линии) и помещают ее на поверхность заранее приготовленного агарового геля, следя за тем, чтобы под ней не образовывались пузырьки воздуха. Можно также быстро окрасить одну половинку полоски, а вторую разрезать на кусочки, так чтобы каждый из них содержал отдельную электрофоретическую фракцию. Эти кусочки пленки помещают на поверхность агарового геля, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Пропитанные соответствующей антисывороткой полоски фильтровальной бумаги шириной 2 мм кладут на гель параллельно кусочкам пленки и на оптимальном расстоянии от них. Это расстояние определяется теми же факторами, что и в случае иммуноэлектрофореза в агаровом геле. После завершения иммунодиффузии с поверхности геля удаляют полоски бумаги и кусочки пленки, а затем фотографируют полученную картину преципитации. Для приготовления стабильных препаратов гель высушивают и окрашивают по методике, предназначенной для иммуноэлектрофореграмм в агаре. Удаление лишних белков перед высушива1нием геля, как правило, не является обязательным. [c.243]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

Фрагмент ДНК, который нужно субклонировать, можно выделить с помощью электрофореза в агарозном геле (необязательно см. методику 25). [c.102]

После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем электрофореза в агарозном геле, следующий эта заключается в переносе (блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые метод блоттинга-описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам метод многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр, используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем чувствительность пр этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3). В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку. Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и традиционный метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном. Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который гораздо быстрее капиллярного (1—2 ч по сравнению с 12—16 ч), но приводит к некоторому снижению чувствительности [4]. После переноса ДНК должна быть зафиксирована на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов найлоновых фильтров. В связи с этим в- [c.287]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология