Иммунный анализ антигены

Другим перспективным направлением в разработке амперометрических биосенсоров является создание устройств, основанных на иммунологических реакциях. Принцип иммунного анализа заключается во взаимодействии исследуемого вещества, называемого антигеном (АГ), со специфически связывающимся с ним антителом (АТ) с образованием комплекса АГ -АТ. При фиксированной концентрации антитела (антигена) равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена (антитела) зависит от его общей концентрации. Таким образом, неизвестную концентрацию антигена (антитела) можно определить при помощи фиксированного количества меченых антител (антигенов). Для этого антиген или антитело метят ферментами. Разработанные к настоящему времени иммуноферментные амперометрические датчики можно классифицировать следующим образом [c.506]

Одно из самых значительных достижений рентгеноструктурного анализа белков последних лет, которое не может не повлиять на дальнейшее развитие биологии и становление ее новой области -молекулярной биологии клетки, состоит в начавшейся расшифровке трехмерных структур первых мембранных белков. Перед обсуждением полученных здесь результатов целесообразно кратко сообщить о том, что было известно об этих белках до исследования их с помощью рентгеновской дифракции. Если основные структурные особенности биологических мембран определяются молекулами липидного бислоя, то специфические функции мембран выполняются главным образом белками. Они ответственны за процессы превращения энергии, выступают в качестве рецепторов и ферментов, образуют каналы активного и пассивного транспорта молекул и ионов различных веществ через мембраны, охраняют организм от проникновения чужеродных антигенов и стимулируют иммунный ответ клеточного типа. В обычной плазматической мембране белок составляет около 50% ее массы. Однако в некоторых мембранах, например во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов, его содержание поднимается до 75%, а в других, например миелиновой мембране, снижается до 25%. Многие мембранные белки пронизывают липидный бислой насквозь и контактируют с водной средой по обеим сторонам мембраны. Молекулы этих белков, называемых трансмембранными, как и окружающие их молекулы липидов, обладают амфипатическими свойствами, поскольку содержат гидрофобные участки, взаимодействующие внутри бислоя с гидрофобными хвостами липидов, и гидрофильные участки, обращенные к воде с обеих сторон мембраны. Другая группа мембранных белков соприкасается с водой только с одной стороны бислоя [234, 235]. Одни из них погружены только во внешний или во внутренний слой мембраны, другие ассоциированы за счет невалентных взаимодействий с трансмембранными белками, третьи прикреплены к мембране с помощью ковалентно связанных с ними цепей жирных кислот, внедренных в липидный слой. [c.56]

Все белки, изученные до сих пор, обладают антигенными св-вами. У белков различают линейные детерминанты, построенные из аминокислотных остатков, расположенных рядом в одном участке полипептидной цепи, и конформационные, к-рые слагаются из аминокислотных остатков разных участков одной или большего числа полипептидных цепей. Антитела, полученные при иммунизации данного животного определенным белком, могут реагировать, хотя и с небольшим сродством, с нек-рыми пептидами, выделенными из гидролизата зтого белка. Такие пептиды, построенные из 5-7 остатков, часто располагаются на изгибах или выступающих отрезках пептидной цепи и, очевидно, являются детерминантами или их частями. Однако в иных условиях, напр, при иммунизации др. вида животного, могут образовываться антитела к иным участкам молекулы того же белкового А. Практически вся пов-сть белковых молекул обладает антигенными св-вами, она, т. обр., представляет собой сумму перекрывающихся детерминант, каждая из к-рых может вызывать иммунную р-цию или не вызывать ее в конкретных условиях. Последние определяются различиями в строении между белковым А, и собственными белками организма, а также регуляторными иммунными механизмами, находящимися под генетич. контролем. По-видимому, почти все детерминанты белков конформационно зависимы. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, антигенные детерминанты обладают повыш. подвижностью. [c.174]

К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену (рис. 9.2). Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет [c.185]

Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I). Так же, как в случае анализа антигенов, все методы определения антител, относящихся к данному разделу, являются неконкурентными (табл. 4.2). [c.90]

Предварительный анализ исследуемых образцов можно легко и быстро провести в слое агара на стеклянной пластинке, разместив лунки на расстоянии 3—5 мм одна от другой в два параллельных ряда. Благодаря небольшому расстоянию между лунками, заполненными антигеном и иммунной сывороткой, полосы преципитации должны появляться весьма быстро. Подобным образом можно также проводить предварительное титрование растворов антигена или иммунной сыворотки, заполнив ряды лунок реагентами в соответствующих разведениях. [c.135]

Для проведения такого анализа необходимо эффективное отделение комплексов от свободных компонентов. Эта задача достаточно легко решаема, если антиген, либо антитело иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и разделить иммунные комплексы и свободные компоненты. Возможность прочного связывания на носителе антигенов или антител с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов привела к созданию твердофазных иммунохимических методов, широко используемых в настоящее время в химическом анализе. [c.114]

В конкурентном иммунном анализе устанавливают число центров, не занятых пробой он может иметь различные варианты, но суть в том, что определяемое вещество пробы смешивают с меченым определяемым веществом, и они конкурируют за активные центры (рис. 7.9-4). Метсд требует разделения связанного и свободного антигена или антитела с целью определения их относительных количеств. Если определяют антиген, присутствие меченого антигена позволяет оценить относительное разделение. Как можно заключить из кривых иа рис. 7.9-3, оптимальная чувствительность достигается при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела. [c.569]

Последующий биохимический и генетический анализ штаммов 1977 г. позволил получить дополнительные данные о сложном эпидемиологическом процессе гриппа. В то время было признано, что антигенный дрейф является следствием точечных мутаций и иммунной селекции и что любой принципиально новый подтип возникает в результате рекомбинации между вирусами человека и животных [41]. Поэтому совершенно неожиданными показались результаты олигонуклеотидного картирования РНК штаммов 1977 г. было установлено, что все 8 генов практически идентичны генам ранее выделенных от людей вирусов [45]. Эти данные были подтверждены при использовании метода РНК-РНК-гибридизации [3, 54]. Они показали, что штаммы 1977 г. не являются рекомбинантами. [c.317]

К представленному выше материалу о Т-лимфоцитах кристаллография белков прямого отношения не имела. В значительной мере поэтому почти все то, что было сказано о функционировании Т-клеток, молекулярных структурах поверхностных белков и их комплексов, природе и побудительных мотивах антитело-антигенных взаимодействий, работе сигнальных систем и регуляторных механизмов носит общий, феноменологический и предположительный характер. Рентгеновские данные о трехмерных структурах мембранных белков и их отдельных доменов, участвующих в функционировании Т-клеточной иммунной системы, начали появляться лишь в 1990-х годах. Поскольку речь идет главным образом о структурах мембранных белков, то использование метода рентгеновской дифракции в клеточной иммунологии сталкивается с большими препаративными трудностями, не в полной мере еще преодоленными. Впрочем, аналогичная ситуация и во всех других направлениях молекулярной биологии, имеющих дело с изучением явлений, протекающих на поверхности клеток. Поэтому при оценке обсуждаемых ниже конкретных результатов рентгеноструктурного анализа следует учитывать, что они означают только обнадеживающее начало широкого проникновения метода в проблематику Т-клеточной иммунологии. [c.70]

Другая возможная функция-это защита от вирусной или бактериальной инфекции. Антигенный материал человеческого происхождения может быть включен во внешнюю мембрану вируса, в результате чего этот вирус труднее распознается организмом другого человеческого индивида. Однако, если вирус содержит МНС-материал от генетического отличного индивида, он может быть намного легче инактивирован иммунной системой. Такой механизм объясняет, почему высокий полиморфизм МНС-системы имеет селективное преимущество. Другая возможная функция МНС-района-защита от заражения опухолевыми клетками других особей того же вида. С таким объяснением хорошо согласуются наши представления о важной роли МНС-сис-темы при трансплантации, а также высокая степень ее полиморфизма. Дальнейшее выяснение свойств и функций главного комплекса гистосовместимости поможет нам решить многие проблемы, например как организм управляет своим взаимодействием со средой и как недавние изменения в окружающей среде могут повлиять на генетическую конституцию в будущем. Полезно задать следующие вопросы существуют ли в природе другие примеры таких генных кластеров с родственными функциями Может ли их анализ изменить что-то в наших представлениях о кластере МНС На самом деле, один такой пример, уже очень тщательно проанализированный, существует-это мимикрия у бабочек. [c.222]

Для целей анализа подбирают такие условия иммунизации животных, при которых образовывались бы антитела с максимальной специфичностью и прочностью связи с антигеном. В зависимости от структуры антигена и поставленной задачи для получения антител используют различные виды животных от мелких лабораторных (мыши, морские свинки, кролики, куры) до крупных (овцы, козы, лошади). После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. При иммунизации крупных животных можно получать большие количества антител для практических целей. В последнее время для иммунизации стали использовать кур, у которых антитела накапливаются в желтке яиц, что упрощает их получение и выделение. [c.103]

Иммуноэлектрофорез. Исследование проводится в два этапа 1) электрофоретическое разделение исследуемого материала в агаре 2) иммунологический анализ. В агаре параллельно оси миграции электрофоретических фракций вырезают траншеи, в которые вносят иммунную сыворотку, содержащую антитела к исследуемым антигенам. В случае реакции между антигенами и диффундирующими в агар антителами формируется преципитат в виде дискретных дуг, соответст- [c.117]

Рис. 7.9-14. Принцип иммунного анализа по поляриза цнн флуоресценции. Связывание антитела с антигеном, мечег1ым флуорофором, увеличивает поляризацию флуоресценции.

Гомогенный тип и простота метода ЛИКА позволяют использовать его для экспресс-анализа антител, оценки связывающей способности иммунных сывороток. Действительно, тепень ингибирования светового излучения конъюгата кофактор— антиген гомологичной иммунной сывороткой пропорциональна концентрации в ней антител и определяется их константой связывания. Анализируя ряд сывороток в одних и тех же разведениях, можно достаточно быстро оценить и сравнить их связываюш,ую способность. [c.127]

Бели определяемое веидаство является антигеном, оно может быть определено с помощью иммунного анализа (см, разд. 7.9), Для проведения такого анализа обычно используют метку, и выбор преобразователя зависит от природы [c.519]

При разработке иммунного анализа целью является проследить за равновесием между антителом и антигеном. При анализе исследуют связывание антигена с антителом и различают связанный и несвязанный антиген. Поскольку процесс имеет равновесный характер (уравнение 7.9-1), линейной зависимости от концентрации антигена нет. Следовательно, важно знать характеристический отклик связьгеания как функцию концентрации антигена. [c.567]

Чрезвычайно широкий спектр применений имеет иммуноанализ для определения как самого факта присутствия, так и измерения количества антигенов, в том числе гаптенов, т.е. низкомолекулярных соединений, к которым можно получить антитела, как правило, путем иммунизации животных конъюгатом гаптена с высокомолекулярным носителем, способным вызывать иммунный ответ. Иммуноанализ нашел широкое применение для анализа содержания различных гормонов, что имеет огромное значение для оценки состояния эндокринной системы человека и животных. Важное значение для оценки состояния окружающей среды, в первую очередь качества питьевой воды и пищевых продуктов, приобретает иммуноанализ содержания пестицидов. В связи с интенсивным развитием гибри-домной техники для анализа определенных антигенов всё более широкое применение находят моноклональные антитела. [c.257]

Для данного флуорофора изменение поляризации флуоресценции зависит от молекулярной массы антигена и природы комплекса с антителом должно иметь место надлежащее изменение молекулярной массы, а этого нельзя добиться с большими антигенами. В целом, хфинято считать, что иммунный анализ ло поляризации флуоресценции неприменим к антигенам с молекулярной массой выше 20000. [c.592]

Ферменты служат, пожалуй, наиболее широко используемыми в иммунном анализе метками, однако они непосредствшно не участвуют в измерении, в отлнчие от изотопов или флуоресцеьгсных меток. Вместо этого, измерение может включать детектирование расхода ферментного субстрата илн накопления продукта, требуя, таким образом, наличия в анализе другого реагента и привнося в метод дополнительные сложности. Тем не менее, поскольку одна молекула фермента может вызвать превращение многих молекул субстрата, имеется очень высокий потенциал усиления сигнала, и это преимущество перевешивает часто упоминаемый недостаток несовместимой оптимизации условий конечного этапа ферментативного анализа и связывания антитело—антиген. [c.594]

Чтобы спровоцировать иммунный ответ, антиген должен обладать свойством иммуногена, как об этом уже упоминалось. С другой стороны, организму (реципиенту) необходимо обладать способностью воспринимать сигнал и включать иммунные механизмы. Например, при анализе генетического контроля иммунного ответа выявлены линии кшшей и морских свинок, одни из которых отвечают на определенный антиген, а другие остаются к [c.34]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

Закономерен вопрос, нельзя ли избежать отмеченных выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от традиционной техники получения антител в результате иммунизации и оперируя вместо этого моноклональными антителами, полученными с помощью гибридомной техники (см. гл. 12). О чевидно, что для детального анализа антигенной структуры, например белков, необходимо использование большого числа индивидуальных клонов. Чтобы учесть генетические особенности иммунного ответа индивидуальных реципиентов, придется производить слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток от генетически неидентичных особей, отбор которых может быть ли,шь случайным. Тем самым степень неопределенности задачи не уменьшится. [c.30]

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Если весь процесс иммуноферментного анализа условно разделить на три основные стадии - формирование специфического комплекса антиген — антитело (иммунохимический процесс), введение в него метки и ее визуализация тем или иным физическим способом, то можно заметить, что основное внимание в данной книге фокусируется на второй и третьей стадиях, представляющих преимущественно энзимологический аспект проблемы. В книге рассмотрены практически все известные способы регуляции активности ферментов, как химические (с помощью активаторов, ингибиторов, субстратов, простетических групп), так и физические (путем изменения активности ферментов при образовании комплекса антиген — антитело, с помощью ультразвука, конформационных и диффузионных ограничений). Главное достоинство монографии состоит в том, что в ней, по-видимому, впервые комплексно рассмотрены возможности регуляции активности ферментов, которые могут быть использованы для создания методов иммуноферментного анализа. В этом смысле оправдано английское название книги Enzyme-mediated immunoassay , которое буквально переводится, как Иммунный анализ, опосредованный через ферменты . [c.5]

Прежде всего, mAb являются прекрасным инструментом количественного и качественного иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунологического (РИА) анализа антигенов любого происхождения. Особо следует отметить их незаменимость в исследовании системы маркеров дифференцировки клеток ( D-маркеров - luster of differentiation ( D) system) в иммунологии. В настоящее время известно более 200 таких маркеров, и по их присутствию на поверхности клеток в разных сочетаниях делают обоснованные выводы о состоянии иммунной системы организма стадиях дифференцировки клеток иммунной системы, уровне их активации и т.п. С помощью проточной цитометрии и флуо- [c.407]

Принцип иммунного анализа прост и основан на взаимодействии исследуемого вещества (лиганда), называемого антигеном (Ag), со специфически связывающимся с ним партнером, называемым антителом (ЛЬ). При этом образуется комплекс антиген/антитело (AbAg) [c.57]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

А. Иммуноэлектрофоретический анализ (ИЭА) [41], Антигены вначале разделяют путем электрофореза в агарозном геле, Верхняя часть рисунка демонстрирует классическое расположение ИЭА нижняя часть ИЭА называется тандемной стрелки показывают положение лунок, в которые заливают перед электрофорезом растворы антигенов. После электрофореза в геле параллельно направлению электрофоретической миграции прорезается канавка, которая заполняется иммунной сывороткой. Антитела и антигены диффундируют в гель, встречаются и образуют дуги преципитации, [c.102]

Примечание. Метол хорон]о приспособлен для анализа сложных смесей с полис пециф и чески ми иммунными сыворотками. Он позволяет проводить антигенное сравнение компонентов в различных сме- сях с полисгсецифическими иммунными [c.102]

Наиболее простой способ исследования растворимых антигенов в реакции преципитации заключается в том, что исследуемый раствор смешивают со специфической иммунной сывороткой, а затем наблюдают образование преципитата. Эта реакция применяется главным образом для определения титров. Только в том случае, когда реакция ставится с иммунной сывороткой, специфичной к данному белку, величина титра может служить характеристикой белкового препарата. Действительно широкое применение имму-нохимического подхода к анализу белков началось только после того, как появились иммунодиффузионные методы исследования. [c.18]

Детали этого метода описаны Кабатом и Мейером [66, 77]. Если можно получить сильные осаждающие антисыворотки, химический анализ преципитата гликопротеин — антитело может дать полезные сведения. Если гликонротеин гомогенен, то весь его гексозамин, гексозы, фукоза и сиаловые кислоты должны быть найдены в иммунном осадке (после поправки на растворимость осадка и если антитело присутствует в избытке). Ценность этой методики для гликонротеинов ясна в противоположность простым белковым антигенам гликонротеины могут содержать значительные количества таких легко определяемых компонентов, которые иммунный у-глобулин содержит только в небольших количествах [78—81]. Естественно, если препарат содержит несколько антигенных компонентов и антисыворотка содержит антитела ко всем этим компонентам, количественный анализ преципитации может указывать на гомогенность, хотя образец загрязнен. При таких обстоятельствах полная кривая осаждения даст большую информацию, и ингибирование осаждения низкомолекулярными веществами (если они доступны) также иногда можно использовать, чтобы отличить гомогенные препараты от гетерогенных. [c.54]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

В целях удобства классификации целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру проведения первой стадии узнавания , которая является определяющей для всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии, а следовательно, формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ. solid phase assay). Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гетерогенные. [c.82]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология