Методы отбора гибридных клонов

МЕТОДЫ ОТБОРА ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ [c.34]

Смесь молекул, полученных после встройки в выбранный молекулярный вектор фрагментов экзогенной ДНК, вводят в компетентные клетки. Если при этом в вектор статистически встраивают большой набор разных фрагментов донорной ДНК, то вероятность встройки каждого конкретного фрагмента невелика. В этом случае необходимо иметь методы, позволяющие в большом многообразии получаемых гибридных клонов выявлять необходимые. В связи с этим в генно-инженерном эксперименте большое значение имеют методы скрининга (отбора) клонов, содержащих целевые гибридные ДНК. [c.34]

Рис. 18.6. Отбор стабильных гибридных клеточных клонов по методу HAT. В том случае, если родительская линия клеток мыши лишена тимидин-киназной активности, на селективной среде HAT будут образовывать колонии только гибридные клетки, содержащие хромосому человека 17. В этой хромосоме расположен ген ТК человека.

После удачного слияния клеток необходимо провести быстрый и эффективный скрининг гибридом. В большинстве случаев дл-ч слияния требуются три этапа скрининга, и поскольку для каждого эксперимента используется свыше 500—1000 лунок, это означает, что для выявления наличия специфических антител нужно проанализировать до 3000 проб. Кроме того, кинетика роста гибридных клеток такова, что результаты скрининга должны быть известны в течение первых 48 ч после отбора проб. Единственный реальный способ обработать такое количество проб — использование метода, который позволяет провести скрининг, дающий визуальные результаты, на планшетах с лунками маленького объема. Скрининг не обязательно дает абсолютно однозначные результаты и допускается выявление некоторого количества ложных положительных клонов. Затем его можно повторить и получить более определенный ответ, работая только с относительно небольшим количеством проб, давших положительный ответ при первом скрининге. Один из наиболее удобных методов скрининга — твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), при котором антиген наносится на дно лунок пластикового планшета он связывает антитела, продуцируемые гибридомой, а наличие этого комплекса обнаруживается с помощью антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с определенным ферментом. Описание иммуноферментного анализа (ИФА) приведено в табл. 6.6. [c.185]

Хотя векторы, несушие два (или более) селектируемых маркера, и позволяют в большинстве случаев отбирать бактерии, содержащие гибридные плазмиды, по инактивации одного из маркеров, однако для этого требуется перенос клонов трансформантов с одной среды на другую методом отпечатков. Это трудоемкая операция, особенно при анализе большого числа клонов. Поэтому в настоящее время сконструированы векторы, позволяющие производить прямой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для этого в векторную молекулу вводят ген, выражение которого в определенных условиях вызывает гибель кпетки. Инактивация этого гена путем интеграции в него чужеродной ДНК делает трансформанты, содержащие гибридные л-олекулы, жизнеспособ- [c.145]

Митотическая стабилизация плазмид, индуцируемая центромерной ДНК, позволила разработать в лаборатории Дж. Карбона (1981 г.) метод прямой селекции фрагментов ДНК, содержащих такие области. Плазмида YRp7 при росте дрожжей в неселективных условиях примерно через 20 генераций полностью элиминируется из популяции клеток, в то время как эта же плазмида, содержащая EN3, сохраняется в таких условиях по крайней мере в 90 % клеток. На этом основан метод клонирования и отбора центромерных районов ДНК, гидролизованную определенной рестриктазой, статистически встраивают в YRp7 после трансформации дрожжевых клеток отбирают клоны, содержащие гибридные плазмиды, и последовательно пассируют их перепечаткой на агаризованной полной среде (неселективные условия). При этом нестабильные плазмиды постепенно элиминируются, а остаются только стабильные варианты гибридных плазмид, которые должны содержать центромерные области. После высева пассированных таким образом клонов на селективную по маркеру плазмиды среду вырастут лишь клоны, несущие стабильные плазмиды. [c.302]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология