Гибридные клоны

Отсутствие у родительской линии мышиных клеток какой-либо существенной функции, например способности синтезировать необходимый метаболит, может быть супрессировано при внесении элементов генома человека. Из такой гибридной линии могут постепенно утратиться все человеческие хромосомы, кроме той, которая содержит ген, отвечающий за незаменимую функцию. Таким образом, можно отобрать гибридные клоны, содержащие конкретные человеческие хромосомы. Такой предварительный отбор облегчает картирование генов, расположенных в этой хромосоме. [c.298]

Первый этап-это слияние соматических клеток человека и мыши. После нескольких клеточных делений образуются клоны, сохранившие лишь одну или несколько человеческих хромосом. Следующим этапом является установление связи между экспрессией данного гена и присутствием определенной хромосомы (или участка хромосомы) в гибридных клонах. [c.291]

Гибридные клоны Хромосомы человека [c.291]

Метод окрашивания и идентификация хромосом. Дальнейшие успехи в картировании связаны с появлением новых методов идентификации индивидуальных хромосом, основанных на их дифференциальном окрашивании. Благодаря этим методам можно идентифицировать не только целые хромосомы, но и отдельные их части. В гибридных культурах довольно часто возникают хромосомные разрывы и перестройки. Это создает предпосылки для подходящей селекции гибридных клонов, содержащих интересующие нас части хромосом. Именно так некоторые локусы были отнесены к определенным хромосомным сегментам (или группе соседних сегментов). [c.202]

Через 10—14 дней гибридные клоны следует осмотреть невооруженным глазом, а затем более тщательно, с помощью инвертированного микроскопа под малым увеличением, чтобы различить отдельные белые пятна в лунках. Записывают число колоний, растущих в каждой лунке. Лучше отбирать колонии, выросшие в тех лунках, которые засевали из расчета 1—0,5 клеток на лунку. Однако если эффективность роста данной линии низка, то, возможно, придется выбирать клон из лунок, в которые было посеяно по 10—5 клеток на лунку, при условии присутствия в лунке только одного клона. [c.143]

Сначала все слияния клеток проводят с предельно допустимыми разведениями популяции клеток — продуцентов МА против антигенов клеточных поверхностей. Последующий анализ обычно дает достаточно определенные результаты для того, чтобы можно было отобрать гибридные клоны, представляющие интерес. Этот этап не прост, если учесть, что первичная иммунизация крыс клетками мышиных лимфом требует 200—300 лунок с растущими клонами. Такое количество образцов нетрудно проверить с помощью ИФМ, однако приблизительно 5—20% лунок содержат клоны, продуцирующие МА против неизвестных мембранных компонентов. Поэтому следует проводить и негативный отбор, чтобы отбраковать клоны, которые секретируют МА к общим для всех клеток поверхностным антигенам. После того как с помощью ИМФ отбирают клоны, позитивные [c.179]

Гибридные клоны обычно растут несколько быстрее и достигают более высокой клеточной плотности (до 2-10 клеток/мл), чем культуры клонов ЦТЛ. [c.289]

КЛОНИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕВЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК В МЯГКОМ АГАРЕ. ВЫЯВЛЕНИЕ ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ, ОБРАЗУЮЩИХ АНТИТЕЛА К БАРАНЬИМ ЭРИТРОЦИТАМ (БЭ) [c.407]

Гибридные клоны лимфоидных клеток 411 [c.411]

Характеристика гибридных клонов [c.68]

Ферменты Гибридные клоны, где обнаружена активность двух ферментов [c.68]

МЕТОДЫ ОТБОРА ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ [c.34]

Смесь молекул, полученных после встройки в выбранный молекулярный вектор фрагментов экзогенной ДНК, вводят в компетентные клетки. Если при этом в вектор статистически встраивают большой набор разных фрагментов донорной ДНК, то вероятность встройки каждого конкретного фрагмента невелика. В этом случае необходимо иметь методы, позволяющие в большом многообразии получаемых гибридных клонов выявлять необходимые. В связи с этим в генно-инженерном эксперименте большое значение имеют методы скрининга (отбора) клонов, содержащих целевые гибридные ДНК. [c.34]

Первичный отбор гибридных клонов значительно упрощается, если в векторной молекуле предусмотрена специальная фенотипическая система селекции. При трансформации клеток чаще всего используют векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции отработана для бактерий, так как получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу к нескольким антибиотикам. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности. [c.34]

Отбор гибридных клонов осуществляют следующим образом. Препаратом ДНК, получен- [c.87]

Существующие в настоящее время векторные фаги Я для каждой конкретной рестриктазы делят на векторы внедрения и векторы замещения. Векторы внедрения имеют на ДНК одно место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенного фрагмента ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-либо гена исходного фага, селекция гибридных клонов осуществляется как выявление соответствующих фаговых мутантов. Рассмотрим типичных представителей этой группы векторов. [c.100]

Селективная среда HAT может быть использована для отбора клонов, содержащих и другие хромосомы. Например, фермент фосфорибо-зил-гипоксантин—трансфераза (HPRT) участвует в синтезе пуринов. Если линия клеток мыши утрачивает способность синтезировать HPRT, то этот дефект может быть возмещен присутствием соответствующего гена человека. Показано, что все гибридные клоны, отобранные по этому признаку, содержат человеческую Х-хромосому, в составе которой находится ген HPRT. Разработаны другие селективные схемы, позволяющие проводить картирование генов, локализованных и на других хромосомах, кроме X и 17. [c.299]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

При наличии практических навыков и тщательной работе прн выращивании клеток в планшетах содержимое лунок не должно подвергаться бактериальному заражению. Совершенно необходимо не переполнять лунки, поэтому никогда не вносите в лунку более 100 мкл среды. В случае если зароет обнаружен в лунке планшета, содержащего важные для работы гибридные клоны, осторожно внесите в лунку 100 мкл 70%-ного этанола, затем отберите из нее все жидкое содержимое и оставьте в сухом месте. При загрязнении лунки с клетками, секретирую-щкми антитела, ее содержимое можно спасти пассированием клеток in vivo. Введите содержимое лунки мыши BALB/ , которой за 2—10 дней до этого было внутрибрюшинно введено 200 мкл полного адъюванта Фрейнда. При удачном стечении [c.195]

Задача оказалась достаточно сложной. К началу исследований отсутствовали данные о структуре белка, что исключало возможность использования как синтетического гена, так и синтетических олигонуклеотидных зондов для скрининга гибридных клонов. Кроме того, было известно, что при максимальной индукции клеток доля интерфероновой мРНК в общем пуле поли(А)-мРНК весьма мала. Это предопределило очень большой объем работ по скринингу гибридных клонов. [c.190]

Если не учитывать это при оценке полученных данных, выявляются трех- и пятикратные различия (в процентах) значений Кон A/WGA по связыванию их с белком (молекулярная масса которого 100 кД), выделенным из немалигнизированных исходных клеток или гибридов с супрессией малигнизации по сравнению с таковым, полученным из исходных или гибридов опухолевых клеток. К сожалению, не показано, как скоро после гибридизации были сделаны эти измерения или является ли экспрессия нормальных белков с молекулярной массой 100 кД также нестабильной в гибридных клонах в состоянии супрессии малигнизации при культивировании их in vitro в течение короткого времени (Jonasson et al., 1977). [c.101]

Примечание. С одной чашки можно снять до семи реплик. Время адсорбции для каздой последующей реплики необходимо увеличивать. Для получения достоверной информации о гибридных клонах необходимо с каждой чашки снимать по две реплики. Подучив информацию о гибридизации на двух фильтрах, нужно сравнить позитивные сигналы и отбросить те, которые не совпадают на обоих фильтрах как неспецифические сигналы. [c.34]

После каждой лигазной реакции образуется смесь разнообразных гибридных молекул ДНК, из которой целевые молекулы с заданной структурой отбирают на стадии введения в клетки и размножения гибридов, а также на стадии селекции и/или анализа гибридных клонов на предмет искомой генетической конструкции. [c.31]

Основной недостаток методов фенотипического выявления гибридных клонов плазмид и вирусов заключается в том, что с их помощью не удается отобрать гибриды, содержащие специфические последовательности ДНК. Последние можно легко выявить методами гибридизации нуклеиновых кислот in situ в колониях трансформированных клеток или в бляшках вирусов. Эти процедуры начиная с 1975 г. интенсивно совершенствовались, и в настоящее время они достаточно просты и активно используются в работах по клонированию генов. [c.34]

В 1980 г описана плазмида pTR262 (Ар> Тс с1+), в которой экспрессия гена tet pBR322 находится под контролем репрессора фага Я. Эта плазмида детерминирует фенотип Тс , но становится Тс> после инактивации фагового гена сГ встройкой в него чужеродных фрагментов ДНК. Поэтому такие гибридные клоны (Ap> Тс> с1 ) легко отбирать на среде с тетрациклином. [c.121]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология