Определение активности рестриктаз

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ РЕСТРИКТАЗ [c.126]

С задачей определения активности рестриктаз приходится сталкиваться в самых различных экспериментах в опытах по поиску продуцентов, изучению влияния условий культивирования на содержание целевых ферментов в биомассе, их очистке и характеристике каталитических свойств. Специфической чертой области энзимологии, посвященной изучению рестриктаз, является тот факт, что в подавляющем большинстве вышеуказанных опытов проводится в основном только качественная оценка активности исследуемых ферментов. Если в случае поиска продуцентов рестриктаз это является оправданным, то в ходе их очистки вынужденным. Последнее обстоятельство объясняется отсутствием простых количественных методов определения активности специфических эндонуклеаз. [c.126]

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электрофоретическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование [c.127]

Определение активности рестриктаз, основанное на использовании кольцевых ДНК молекул [106,107], применимо [c.128]

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага X при оптимальных условиях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от pH, ионной силы, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции. Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии. [c.27]

В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. соИ, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами — рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются около 200. [c.25]

Если для получения определенного фрагмента требуется обработка двумя рестриктазами, активными в совершенно разных буферах, а также когда необходимо удалить один из ферментов, можно использовать изложенный ниже метод, чтобы получить промежуточный продукт для последующих экспериментов. [c.279]

Применение хроматографических методов разделения нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз основано на использовании с этой целью их разницы в молекулярных весах, значений и величин заряда. Учитывая определенную избирательность используемых с этой целью хроматографических материалов и то, что большая часть процессов по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз осуществляется в одной стадии в колоночном режиме, следовало бы ожидать совмещения решения вышеуказанной задачи с определенной как функциональной, так и абсолютной очисткой рестриктаз от сопутствующих примесных нежелательных активностей и белков. [c.148]

Ряд предложенных и апробированных для определения активности рестриктаз методов в настоящее время имеет только историческое значение. В первую очередь это замечание относится к биологическим методам, примеры применения которых имеются не только в случае рестриктаз I и П1 типов [93, 112, 140] но и П типа 1158,271]. Этим методом, основанным на определении снижения трансфекционной способности фаговых ДНК, обработанных in vitro исследуемыми ферментами, характерна трудоемкость, низкая точность и большая продолжительность, обусловленная в первую очередь временем, необходимым для проявления биологической активности фагов (лизис клеток). Ультрацентрифугирование и визкозиметрический метод, использованные для определения активности нескольких первых специфических эндонуклеаз 1158,182,253], тоже отличают- [c.126]

Вышеуказанные методы не нашли широкого применения и потому, что был разработан более простой и более информативный способ определения активности рестриктаз, основанный на разделении продуктов реакции — фрагментов 3,НК, различающихся по длине, электрофорезом в агарозных гелях. В первых вариантах применения этого метода визуализацию разделенных фрагментов ДНК проводили авторадиографией [1821 или путем окрашивания акридиновым оранжевым [271]. Апробация с этой целью этидиума бромистого, дающего при освещении гелей УФ светом флуоресцирующие зоны ДНК, Шарпом с сотр. [241] продемонстрировала высокую чувствительность обсуждаемого способа детекции ДНК и способствовала повсеместному применению электрофоретического метода для оценки активности рестриктаз. [c.127]

Резюмируя рассмотрение количественных методов определения активности рестриктаз, следует отметить, что они являются адекватными приемами для изучения кинетических параметров катализируемых этими ферментами реакций. Несомненно, что в аналогичных опытах они найдут применение и в будущем. Однако, их использование в таких экспериментах, как, например, очистка рестриктаз и изучение влияния условий культивирования на содержание целевых предметов в биомассе, является малопривлекательным. Это, кроме отмеченных выше ограничений, выражающихся в необходимости подбора в каждом конкретном случае подходящих субстратов, обуслов-ленно трудоемкостью приготовления таких субстратов (это замечание особенно касается радиоактивных субстратов) и анализа продуктов реакции. На всех этих этапах необходимо располагать уникальной аппаратурой и возможностью работать с изотопами. Хотя часть из обсуждаемых методов и была использована в единичных опытах по очистке рестриктаз [106, 163, 184, 254,], по вышеизложенным причинам они распространения не получили. Их трудоемкость является очевидной, а выигриш в точности определения в таких опытах по сравнению с электрофоретическим методом не окупает затрат. [c.129]

Известен другой количественный метод определения активности рестриктаз, тоже основанный на применении иммобилизированной ДНК [229]. Однако в последнем случае используется радиоактивная ДНК заполимеризованная в полиакриламидном геле. Этот метод уступает спектрофотометрическому в универсальности, так как он применим только к частощепящим рестриктазам. Кроме того его применение связано с использованием радиоактивного субстрата. [c.130]

Использование этих приемов, позаимствованных из методического арсенала определения активности рестриктаз I типа [181], способствовало открытию ряда других первых специфических эндонуклеаз [ПО, 182, 244]. Несмотря на успешное применение ультрацентрифугирования и вискозиметрического метода, сразу стало очевидным их принципиальное ограничение, выражающееся в том, что эти методы регистрируют любую эндонуклеазную активность и, таким образом не являются изби- [c.135]

В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди Очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие отсутствие сайтов узнавания может иммитироваться природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241],. из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей,, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка- [c.140]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Рестриктазы, впервые открытые благодаря их действию nat чужеродную ДНК, попавшую в бактериальную клетку, пред ставляют собой основной рабочий инструмент молекулярного-биолога. К настоящему времени охарактеризованы многочисленные ферменты рестрикции, но наибольшее внимание уделяется ферментам типа II, поскольку именно они узнают определенные последовательности нуклеотидов внутри или окола-сайта их действия и разрезают обе нити двухцепочечной молекулы ДНК определенным образом. Обычно за единицу (ед.) активности рестриктазы принимают активность, при которой- [c.278]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Значительная часть исследований, в особенности на первом этапе изучения рестриктаз, была посвящена поиску, очистке и характеристике специфичности рестриктаз. Это направление исследований не потеряло своей актуальности и в настоящее время и стимулируется как желанием обнаружить новые по специфичности ферменты с целью их дальнейшего применения в качестве аналитических реагентов, так и необходимостью изучения таких фундаментальных вопросов как закономерность распространения рестриктаз и вариабильность их субстратной специфичности. В настоящем разделе будут рассмотрены некоторые методические аспекты решения обсуждаемых, а также ряда других задач (определение активности, клонирование генов рестрикции-модификации). [c.126]

В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов. [c.163]

Какова роль метилирования G Эксперименты, проведенные с использованием рестриктазы Hpall, свидетельствуют о том, что ДНК неактивных генов метилирована сильнее, нежели ДНК активных генов. Более того, оказалось, что неактивный ген, ДНК которого метилирована, после активации теряет большую часть своих метальных групп. Убедительное доказательство того, что именно метилирование влияет на экспрессию генов, получено в опытах с 5-азацитозином (5-aza- , см. рис. 10-44,6), который на короткий период добавляли к культивируемым клеткам. 5-aza- , аналог основания, не способный метилироваться, включается в состав ДНК и действует в качестве ингибитора поддерживающей метилазы, снижая таким образом общий уровень метилирования ДНК. В клетках, обработанных 5-aza- , определенные ранее неактивные гены активировались и одновременно получали неметилированные остатки С. После разовой активации активное состояние этих генов поддерживалось и в отсутствие 5-aza- во многих последующих поколениях клеток. Этот факт указывает на то, что изначальное метилирование генов способствовало их пребыванию в неактивном состоянии. [c.217]

Еще одной важной особенностью активного хроматина является деметилирование определенных участков ДНК. В неактивных генах большая часть цитидиловых остатков в составе СО-последовательностей метилируется. Впервые Б. В. Ванюшиным в лаборатории А. Н. Белозерского было продемонстрировано, что ДНК в разных тканях одного животного различаются по уровню метилирования С. На основании этого было высказано предположение о возможной регуляторной роли метилирования в дифференцировке. Позднее многими авторами было показано, что в транскрибирующейся ДНК некоторые области оказываются недометилированными. Наиболее широко используемый метод анализа — сравнение рестриктных карт, полученных с рестриктазами, узнающими одну и ту же последовательность, например СОСО или ССОО, но обладающими разной чувствительностью к метилированию. Одна из рестриктаз расщепляет и метилированную и не-метилированную последовательности, а другая — только неметилироваиную. Обычно неметилированные последовательности локализованы в регуляторной области гена. Область собственно гена, его кодирующей части и интронов одинаково метилирована как в работающих, так и в молчащих генах. [c.162]

II и III. Все рестриктазы узнают на дв)спиральной ДНК строго определенные нуклеотидные последовательности. Однако рестриктазы класса I осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы классов II и III узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнава-нмя или на фиксированном от них расстоянии. Ферменты типов 1 и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей — модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Ферменты И-го класса состоят из двух отдельных белков рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. В силу указанных причин в генной инженерии используют исключительно рестриктазы класса II. [c.139]

Для определения воздействия репликации на транскритщию вы собираете транскрипционные комплексы на полностью метилированном макси-гене, индуцируете репликацию и изучаете транскрипционную активность до и после обработки рестриктазами. Результаты приведены на рис. 10-11,5. [c.176]

Одной из наиболее интересных новых разработок является создание гибридных интерфероновых генов с использованием удобных общих участков расщепления рестриктазами. Таким способом могут быть получены многие гибридные интерфероны с определенными биологическими и фармакологическими свойствами. Интересно выяснить, можно ли улучшить в каких-либо отношениях природные гены интерферонов. Эта область только начинает развиваться, поскольку определение свойств рекомбинантных молекул интерферонов требует времени. К интересным для изучения свойствам интерферона относится его специфичность по отношению к мишени. Даже природные виды а-ИФН сильно различаются по этому признаку. Некоторые виды а-ИФН более активны в клетках человека по сравнению с клетками быка, другие наоборот некоторые активны в клетках кролика, другие в той же степени активны в мышиных клетках [260]. Сейчас создано несколько гибридных генов а-ИФН человека [230, 262] и оказалось, что они сильно различаются по своей способности подавлять размножение разных вирусов в различных клетках и в организме разных животных [261]. Удалось идентифицировать отдельные аминокислотные остатки, от которых существенно зависит хозяйская специфичность интерферона [191]. [c.46]

Резюмируя рассмотренные выше литературные данные, следует обратить внимание на тот факт, что использование в ряде работ по поиску рестриктаз первичной очистки бесклеточных экстрактов, предшествовавшей проверке наличия специфических эндонуклеаз в исследуемых штаммах, возможно, не было оправданным. В цитированных источниках [104, 246, 258, 261] не имеется указаний, чем руководствовались авторы, выбрав путь тестирования частично очищенных препаратов. Было ли это вызвано невозможностью определения рестриктазной активности непосредственно в бесклеточных экстрактах или частичная очистка была введена в эксперименты без предварительных опытов Если такие эксперименты не проводились, то в общем случае в ходе такой слепой очистки (неконтролируемой по активности целевого фермента) не исключена потеря целевых ферментов. Удаление нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом может сопровождаться соосаждением значительных количеств рестриктаз. Поэтому слепое использование этого приема для первичной очистки бесклеточных экст- [c.137]

В поиске путей решения вышеперечисленных вопросов определенный вклад могут внести биологические методы поиска СХС. Известны случаи, когда достоверно биологическими методами доказано существование СХС, но определить эндонуклеазную активность in vitro не удается [81, 150, 265]. Причины этого явления могут быть тривиальными (например, инактивация ферментов в бесклеточных экстрактах) или более сложными (потребность в неизвестном кофакторе (—ах)). Целенаправленное изучение причин этого явления могло бы способствовать поиску подходов в решении проблемы тестируемости хотя бы части рестриктаз биохимическими методами. [c.141]

В тех случаях, когда продукты рестриктазной реакции имеют полностью спаренные концы, анализ 5 -концевой последовательности дает информацию лишь о структуре половины сайта. В отсутствии сведений об узнаваемом участке, полученных независимыми методами (например, косвенными), для большей достоверности анализ З -коицов является необходимым. Чаще всего для этой цели используется метод анализа ближайших соседей. В таких случаях применение ДНК полимеразы Т4, благодаря присущих ей полимеразной и 3 ->-5 экзонуклеазной активностей, позволяет в присутствии меченных нуклеозидтрифос-фатов ввести 2Р-меченый З -концевой нуклеотид. После гидролиза рестриктов соответствующими фосфодиэстеразами и анализа продуктов реакции определяется ближайший сосед включенного меченого предшественника [99, 166]. В результате такого анализа устанавливается структура З -концевого динуклеотида рестрикционного фрагмента. Обсуждаемый методический подход нашел применение в экспериментах по определению субстратной специфичности рестриктаз Xma I [92] и Hind III [195]. [c.176]

Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов и разрезают двуните-вую ДНК на фрагменты. Модификация заключается в метилировании определенных оснований в последовательности, узнаваемой сопряженной рестриктазой тем самым обеспечивается защита данного участка ДНК от воздействия рестриктазы. Одновременное наличие в клетке этих д ферментативных активностей (так называемая R- система) препятствует гидролизу собственной нуклеиновой кислоты. Чужеродная же ДНК при проникновении в бактериальную клетку служит субстратом для обоих ф )-ментов. [c.14]

Прежде всего была создана плазмида, имеющая в своем составе слитые части генов lad и la Z при транскрипции и трансляции такого химерного гена образуется белок с ферментативной активностью /З-галактозидазы. Слитый ген la l - Z в плазмиде pLG (рис. 3.8) не имеет промотора и поэтому не экспрессируется. Встройкой линкеров в начало структурной части этого гена можно вводить различные места узнавания рестриктаз. Для каждого конкретного случая выбирается определенная последовательность нуклеотидов вводимого линкера. Если по выбранному месту расщепления рестриктазой встроить последовательность любого гена X, кодирующую N-шнцевую часть полипептида, то образованный гибридный ген будет детерминировать синтез химерного белка, по-прежнему обладающего ферментативной активностью )3-галактозидазы. ДНК полученной [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология