Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Олигонуклеотиды сборка гена

    Один из способов конструирования синтетического гена заключается в получении набора олигонуклеотидов длиной 20-60 нуклеотидов каждый с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности цепей задают так, чтобы после отжига концевые сегменты гена имели тупые концы. Каждый внутренний сегмент имеет выступающие У- и 5 -концы, комплементарные таковым соседнего сегмента (рис. 5.9). После сборки гена остается сшить од- [c.86]


Рис. 5.9. Сборка синтетического гена из коротких олигонуклеотидов. Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной от 20 до 60 звеньев каждый с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге из них образовалась двухцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4. Рис. 5.9. Сборка синтетического гена из <a href="/info/1517677">коротких олигонуклеотидов</a>. Синтезируют отдельные <a href="/info/1780075">олигонуклеотиды длиной</a> от 20 до 60 звеньев каждый с такими <a href="/info/98217">нуклеотидными последовательностями</a>, чтобы при отжиге из них образовалась <a href="/info/1382081">двухцепочечная молекула</a>. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4.
    Несмотря на то, что метод Кораны в принципе прост, на практике возникает ряд осложнений, приводящих к ошибкам при синтезе целевого гена. Например, для того чтобы снизить ошибки при синтезе олигонуклеотидов, последние должны быть достаточно коротки, в то же время ДНК-дуплексы в местах перекрывания олигонуклеотидов должны быть прочны, чтобы обеспечить правильную сборку цепи. Необходимо избегать образования любых неправильных [c.69]

    Всего было синтезировано 56 олигонуклеотидов длиной 40 звеньев, кодирующих обе цепи целевого дуплекса. Разбиение на олигонуклеотиды осуществлено таким образом, чтобы каждый из НИХ перекрывался с соседними фрагментом длиной в 20 нуклеотидов. Ген Ыа был фланкирован для удобства клонирования сайтами рестриктазы 1. В целом ген синтезирован в 4 стадии синтез олигонуклеотидов, сборка гена, амплификация гена, клонирование искусственного гена в pU 322. 76 % полученных при клонировании колоний имели ожидаемый фенотип Тс Однако единственный секвенирован-ный клон имел в составе целевого гена три мутации. [c.76]

    Хотя оба метода позволяют получать полинуклеотиды длиной до 100 нуклеотидов и более, с их помощью нельзя получить функциональные гены. Поэтому синтетические олиго- и полинуклеотиды, используемые для сборки гена, и в настоящее время сшивают способом, который на заре развития полинуклеотидно-го синтеза был предложен Г.Корана для соединения 20-мерных олигонуклеотидов, полученных фосфодиэфирным методом (рис. 83). Для соединения олигонуклеотидов I и II используется третий, вспомогательный, нуклеотид III, которых комплементарен 5 -концу одного и 3 -концу другого олигонуклеотида, образуя дуплекс с ником. Этот вспомогательный нуклеотид III играет роль матрицы для олигонуклеотидов I и II, причем его 3 -конец комплементарен 3 -концу олигонуклеотида II, а 5 -конец — 5 -концу олигонуклеотида I, несущего фосфомоноэфирную группу. Размер матрицы должен обеспечивать достаточную устойчивость дуплекса с ником, для чего каждый из сшиваемых олигонуклеотидов должен перекрывать матрицу III длиной по 8—10 пар нуклеотидов. Обработка комплекса олигонуклеотидов I, II и III ДНК-лигазой в присутствии доноров остатков АМР (АТР или NAD ) приводит к сшиванию олигонуклеотидов I и II. Как видно из рис. 83, двуцепочечный фрагмент образуется с выступающими одноцепочечными концами. Эти концы могут быть использованы для дальнейшего наращивания цепи. Для этого необходимо синтезировать олигонуклеотиды IV и V, частично перекрывающие выступающие 3 - и 5 -концевые фрагменты I — II нуклеотида. Обработка комплекса, содержащего олигонуклеотиды I — II, III, IV [c.298]


    Хотя первый из описанных выше подходов теоретически пригоден для построения генов любой длины, на практике по мере увеличения числа последовательных лигазных сшивок становится все труднее очищать продукты реакции и получать нх а достаточном для дальнейшей работы количестве. Кроме того, увеличивается расход исходных синтетических олигонуклеотидов. В то же время второй подход пригоден только для получения фрагментов длиной не более 200 — 250 п. о. В связи с этим для облегчения сборки гена (очистки фрагментов и экономии нуклеотидного материала) более целесообразно составлять его из отдельных модулей, предварительно очищенных промежуточным клонироввнием. [c.372]

    Совр. методы хим. синтеза Н.к. позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в т.ч. целые гены. Методич. основы хим.-ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной. Они включают 1) хим. сиитез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из к-рых затем в результате комплементационных взаимод. выстраиваются дуплексы-фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях 2) соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетнч. однотяжевых олигонуклеотидов проводят в неск. этапов (рис. 4). Сначала (а) [c.299]

Рис. 5.10. Сборка протяженного гена in vitro с участием ферментов. Вначале химическими методами синтезируют отдельные олигонуклеотиды с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге между ними образовывались спаренные участки длиной 6—10 пар нуклеотидов. Оставшиеся между ними бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I Е. соИ, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4. Рис. 5.10. Сборка протяженного гена in vitro с <a href="/info/765504">участием ферментов</a>. Вначале <a href="/info/5455">химическими методами</a> синтезируют отдельные олигонуклеотиды с такими <a href="/info/98217">нуклеотидными последовательностями</a>, чтобы при отжиге между ними образовывались спаренные участки длиной 6—10 пар нуклеотидов. Оставшиеся между ними <a href="/info/99137">бреши заполняют</a> с помощью ДНК-полимеразы I Е. соИ, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4.
    Метод ПЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесения специфических мутаций in vitro, сборки полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов, секвенирования ДНК. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продук-та. Однако прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, по- [c.97]

    Следующим щагом в развитии методов химического синтеза генов стало создание специализированных компьютерных программ, которые позволят оптимизировать структуру олигонуклеотидов, чтобы свести к минимуму образование комплексов, приводящих к появлению побочных продуктов. Одним из первых примеров использования такой программы для выявления самокомплементарных и повторяющихся последовательностей оснований служит работа по синтезу гена эпидермального фактора роста, предназначенного для экспрессии в клетках Е. oll. Целевой ген, кодирующий 53 аминокислоты, был разбит на 23 олигонуклеотида. На рис. 1.42 приведен фрагмент составленной с помощью ЭВМ схемы последовательной сборки целевой ДНК из 17 промежуточных блоков-интермедиатов, каждый из которых был выделен в индивидуальном состоянии. Несмотря на оче- [c.63]

    Для преодоления неправильного комплек-сообразования и избавления от необходимости очистки промежуточных субфрагментов при синтезе искусственных генов методом Кораны предложена последовательная сборка ДНК на твердой матрице (рис. 1.50). Нерастворимый носитель с присоединенным к нему стартовым олигонуклеотидом последовательно обрабатывают небольшим молярным избытком фосфо-рилированных по 5 -концу олигонуклеотидов. Перед добавлением очередного олигомера избыток предьщущего отмывается. По окончании процесса комплексообразования проводят сшивку дуплекса и отщепление его от носителя. Затем дуплекс клонируют в необходимом векторе. [c.69]


Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды сборка гена: [c.62]    [c.371]   
Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.86 , c.87 , c.87 ]




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

Олигонуклеотиды

Сборка



© 2025 chem21.info Реклама на сайте