Олигонуклеотиды, последовательность

Полученные таким образом характеристики отражают насыщенность олигонуклеотидами различных типов протяженных участков последовательностей функциональных сайтов. Схема получаемых в данной модели характеристик представлена на рисунке 5. [c.230]

Поэтому для уточнения полученой закономерности был проведен анализ частот олигонуклеотидов в 5 и З направлениях от каждой пары в последовательности. [c.233]

Нуклеаза стафилококков является примером фосфодиэстеразы с малой субстратной специфичностью, поскольку она расщепляет ДНК, РНК и олигонуклеотиды до З -мононуклеотидов [31]. Нуклеаза стафилококков получена в кристаллическом виде определены ее аминокислотная последовательность и трехмерная структура. Необычность фермента заключается в том, что для проявления активности он нуждается в ионах кальция. Ион металла присоединяется к нуклеазе только в присутствии субстрата или ингибитора, например тимидин-3, 5 -дифосфата. Нуклеаза стафилококков действует как эндонуклеаза, но после того, как осуществлены разрывы цепи, она может действовать как экзонуклеаза. [c.145]

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза одноцепочечных ДНК-фрагментов с заданной нуклеотидной последовательностью методология молекулярного клонирования и характеризации ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов [c.80]

Для преодоления неправильного комплек-сообразования и избавления от необходимости очистки промежуточных субфрагментов при синтезе искусственных генов методом Кораны предложена последовательная сборка ДНК на твердой матрице (рис. 1.50). Нерастворимый носитель с присоединенным к нему стартовым олигонуклеотидом последовательно обрабатывают небольшим молярным избытком фосфо-рилированных по 5 -концу олигонуклеотидов. Перед добавлением очередного олигомера избыток предьщущего отмывается. По окончании процесса комплексообразования проводят сшивку дуплекса и отщепление его от носителя. Затем дуплекс клонируют в необходимом векторе. [c.69]

Эту последовательность реакций можно повторять, пока не будет синтезирована желаемая полипептидная цепь. Отметим, что на каждой стадии растущая полипептидная цепь переносится на олигонуклеотидный носитель, а после окончания синтеза оли-гонуклеотидный носитель отщепляют от нерастворимой матрицы. Олигонуклеотид, прикрепленный к полипептидной цепи, облегчит хроматографическую очистку полипептида, а затем его можно отщепить мягкой щелочной обработкой. [c.66]

Разработаны методы синтеза полинуклеотидов — простейших моделей нуклеиновых кислот. Эти методы послужили основой для синтеза олигонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов. Использование химических и биохимических методов синтеза дали возможность Каране получить полинуклеотид, соответствуюший активному фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты. Все эти достижения в области исследования строения, функций и синтеза биополимеров позволили на другом, новом—молекулярном уровне подойти к изучению жизненных процессов. Есть все основания предполагать, что в ближайшее время нас ждут большие и интересные открытия в мире познания самых сложных и тонких областей жизнедеятельности организма (деятельности нервной системы, межклеточного взаимодействия, явлений иммунитета и т. д.). [c.54]

В последние годы параметры В-, А- и Z-форм двойных спиралей ДНК удалось уточнить высокоразрешающим рентгеноструктурным анализом монокристаллов самокомплементарных синтетических олигонуклеотидов, образующих короткие двойные спирали (дуплексы). При этом можно оценить конформацию каждой нуклеотидной пары в дуплексе. Оказалось, что внутри двойной спирали сушествует конформационная микрогетерогенность в зависимости от последовательности нуклеотидных пар конформации сахаров в нуклеотидных остатках несколько отличаются. 2 го приводит к отличиям в межнуклеотидных расстояниях вдоль оси спирали и к различному наклону пар оснований к этой оси. Такие зависящие от первичной структуры различия во вторичной структуре ДНК, по-видимо.му, чрезвычайно важны для ее функционирования. [c.29]

ДНК-аза яда кобры известна как ингибитор роста опухолевых клеток. Эта же эндонуклеазная ДНК-аза, а также РН1 -аза и экзонуклеазная фосфодиэстераза широко применяются для определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах и олигонуклеотидах (Zeller, 1966). [c.190]

В данном блоке на первом этапе производится расчет частот встречаемости моно-, ди-. три-, и тетрануклеотидных фрагментов в последовательностях. Значения каждой характеристики представляют собой частоты встречаемости олигонуклеотида определенного типа в данных последовательностях- [c.230]

Такую смесь меченых фрагментов олигонуклеотида снова подвергают двумерному фракционированию электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, как описано выше, а затем проводят авторадиографию. Однако теперь вместо разбросанных по всей иластпнке иятен фингерприита получается зигзагообразная цепочка следующих друг за другом пятен (рис. 173), анализ расположения которых дает информацию о последовательности нуклеотпдов в олигонуклеотиде. [c.504]

Рис. 173. Определение последовательности нуклеотидов в олигонуклеотиде методом блуждающего пятна (см. текст) [Silberklang et al., 1977]

Другой подход к решению задачи об установлении последовательности мономеров в НК связан с развитием методов последовательного отщепления мономеров с одного из концов полимерной цепи. Хотя трудно представить, чтобы этим путем можно было осуществить деструкцию полимера, содержащего тысячу и более мономерных единиц, что имеет место в природных НК, однако значение этого пути несомненно хотя бы для установления строения олигонуклеотидов, получающихся при частичном разрыве полимерной цепи. В настоящее время известны подходы к решению этой задачи как для полирибонуклеотидов, так и для полидезоксирибонуклеотидов. [c.252]

В 1958 г. Хорана предложил для последовательной деструкции цоли-дезоксирибонуклеотидов использовать избирательный ферментативный гидролиз. Были найдены два специфических фермента, которые избирательно расщепляли 3 -5 -связь дизамещенного эфира по месту связи Ссз)—О или С сз)—С ("5) — О. Фосфодиэстераза селезенки расщепляла эту связь по месту С(5)—О, оставляя С (з)-фосфат, диэстераза змеиного яда — связь С (3) —О, оставляя С (5)-фосфат. Так как в полимерной цепи ДНК или соответствующего олигонуклеотида с одного края всегда находится нуклеотид со свободной С (3)-гидроксильной группой, а с другой стороны цепь заканчивается нуклеотидом со свободным С (Г)-гидроксилом, то, очевидно, можно, действуя тем или иным ферментом, последовательно разрушать цепь с одного из ее концов, идентифицируя отщепляющиеся мононуклеотиды с помощью бумажной хроматографии. [c.254]

Как всегда при выяснении строения сложного органического соединения, в том числе и специфического полимера, можно идти и синтетическим Путем, т. е. получать соединения с заранее заданным строением, и, сравнивая их с веществами природного происхождения, выносить суждение о строении последних. При определении строения полинуклеотидов речь должна идти о синтезе специфических олигонуклеотидов, т. е. таких, в которых имеется совершенно определенная заданная последовательность мононуклеотидных звеньев. Рассмотренный выше метод неспецифической полимеризации мононуклеотидов (стр. 251) для этой цели непригоден, так как необходимо иметь метод, который позволил бы создать цепь постепенно, наращивая мононуклеотидные звенья в нужном порядке. [c.254]

РИС. 2-37. Двумерная нуклеотидная карта, полученная в результате частичного гидролиза Р-олигонуклеотида, отщепленного от кольцевой копии ДНК, синтезированной иа цепи глобниовой мРНК (гл. 15, разд. Ж.4). Олигонуклеотид обрабатывали экзонуклеазой из змеиного яда (фосфодиэстера-зой, табл. 2-11), отщепляющей нуклеотиды последовательно с З -конца. Самое верхнее пятно соответствует нуклеотиду неизвестного состава каждое следующее расположенное ниже пятно содержит иа одно нуклеотидное звено больше. По относительной подвижности промежуточных продуктов (см. текст) была восстановлена последовательность (5 )- [c.172]

Анализ последовательности леотидов в ДНК Олигонуклеотиды ДДСН-белковые комплексы [c.99]

Особый интерес представляют, конечно, взаимодействия рибосомных белков с высокополимерными рибосомными РНК (16S и 23S РНК прокариот или 18S и 28S РНК эукариот), ибо они представляют собой основной ковалентный каркас и структурное ядро рибосомных субчастиц. По-видимому, больщинство рибосомных белков контактируют и так или иначе взаимодействуют с высокополимерными рибосомными РНК. Однако среди них можно выделить специальные сердцевинные РНК-связывающие белки, которые прочно взаимодействуют с соответствующей рибосомной РНК, более или менее независимо от других белков. Такими белками малой (30S) рибосомной субчастицы Е. соИ, независимо вступающими в комплекс с 16S РНК, являются S4, S7, S8, S15, S17 и S20. Каждый из них связывается только со специфическим местом на 16S РНК, узнавая его нуклеотидную последовательность и пространственную структуру. Эту последовательность можно выявить таким путем изолированный белок добавляется к рибосомной РНК, в результате чего образуется специфический белок-РНК-комплекс комплекс переваривается рибонуклеазой, так что негидролизованной остается лищь та часть нуклеотидной последовательности, которая закрыта белком эта защищенная последовательность определяется и, таким образом, идентифицируется. Другой метод локализации белков на первичной структуре рибосомной РНК — ковалентная сщивка (например, фотоиндуци-рованная) белка с РНК непосредственно в составе рибосомы, с последующим удалением несшитых белков, перевариванием РНК с помощью РНКазы и идентификацией сшитого олигонуклеотида. Расположение мест связывания вышеуказанных шести белков вдоль цепи 16S РНК схематически показано на рис. 59, а. Видно, что белки [c.100]

Расщепление цепи может идти вслед за химической апурини-зацней полинуклеотида. Например, дифениламин в водной муравьиной кислоте будет расщеплять ДНК до олигонуклеотидов с образованием некоторого количества неорганического ортофосфата схема (11) [34]. Эту реакцию интенсивно использовали для определения последовательности в нуклеиновых кислотах. [c.146]

Деметилирование (39) пиридином с последующей обработкой деметилированной соли фосгеном приводит к (37). Последовательная реакция (37) с двумя различными спиртами дает несимметричный фосфодиэфир (вероятными интермедиатами являются пятивалентные производные). Катализируемое гидроксид-ионом отщепление диметилацетоинового остатка от триэфира происходит по крайней мере в 10 раз быстрее, чем гидролиз триметилфосфа-та. Поскольку реагент (37) был применен лишь для синтеза модельных фосфодиэфиров, предполагали, что его можно использовать для получения олигонуклеотидов [49]. Однако реагент (37), подобно всем тетраэфирам пирофосфорной кислоты, очень чувствителен к действию воды и может быть использован только в абсолютно безводных условиях. Это значительное неудобство в области нуклеотидов, где субстраты часто лишь с трудом растворяются в безводных растворителях. [c.159]

Идея использования твердофазной подложки в последовательном синтезе полимера с определенной последовательностью была развита Меррифильдом для работы с пептидами (см. гл. 23.6). Ранние попытки применить эту идею и сходную технологию для синтеза олигонуклеотидов были сравнительно безуспещны [1]-. Попросту говоря, растущий олигонуклеотид, по-видимому, образует клубок вблизи полимерной подложки, что делает его конец недоступным для дальнейщего удлинения выходы значительно снижаются прежде, чем количество нуклеотидов достигает двузначной цифры. Эта ситуация, по-видимому, была преодолена, когда обратились к новому типу полиамидной подложки, которая [c.183]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Среди продуктов реакции открыты также моно- и динуклеотиды. Типичными представителями этих ферментов являются ДНКазы поджелудочной железы. Одна из них (ДНКаза I) была получена в чистом виде, расшифрована последовательность всех ее 257 аминокислотных остатков. Фермент наиболее активен при pH 6,8-8,0, активируется двухвалентными ионами Mg и Мп и ингибируется конечными продуктами ферментативной реакции - олигонуклеотидами. [c.499]

Была получена двуспиральная ДНК, т. е. ген, кодирующий синтез этой тРНК. Синтез первой цепи ДНК осуществлялся присоединением олигонуклеотидов к растущей последовательности при участии ферментов ДИК-лигаз и АТФ в качестве источника энергии. Вторая цепь получалась в редупликационном синтезе (см. стр. 585). [c.588]

Меченые ДНК-зонды можно получить разными способами. Один из них, называемый методом случайных праймеров, основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов. Некоторые из этих олигонуклеотидов оказываются комплементарными последовательностям ДНК-мище- [c.65]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

С появлением приборов для автоматического химического синтеза ДНК (ДНК-синтезаторов) получение одноцепочечных олигонуклеотидов длиной <50 звеньев стало более или менее рутинной процедурой. Основным компонентом любого ДНК-синтезатора является система клапанов и насосов, с помощью которых в реакционную смесь по строго заданной программе вводятся нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединять к 5 -гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке, а продолжительность каждой из них и время отмывания контролируются с помощью компъютера. [c.80]

Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды, последовательность: [c.279] [c.43] [c.43] [c.20] [c.326] [c.25] [c.373] [c.500] [c.503] [c.506] [c.230] [c.421] [c.301] [c.171] [c.20] [c.326] [c.142] [c.170] [c.568]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология