Аффинный электрофорез

Аффинный электрофорез дает следующие преимущества при определении констант диссоциации [c.169]

Как и другие аффинные методы, аффинный электрофорез основан на том, что поведение интересующего нас фермента изменяют путем введения специфического по отношению к нему лиганда. В данном случае под поведением понимается электрофоретическая подвижность. Существуют два возможных способа проведения такого электрофореза. Первый — включение заряженного лиганда в буфер, что приводит к повышению или снижению подвижности белка в зависимости от разницы между значениями его суммарного заряда в отсутствие и в присутствии лиганда. При препаративном электрофорезе в отсутствие лиганда происходит отделение группы белков с одинаковой средней подвижностью. Если подвергнуть такой образец повторному электрофорезу в присутствии лиганда, то нужный фермент должен отделиться от неспецифических белков (рис. 5.19). Однако это не более чем теоретические предпосылки. [c.224]

Рис. 5Л9. Принцип аффинного электрофореза первого типа (см. текст). А. Без лиганда. Б. Фракция, содержащая фермент, подвергнута повторному электрофорезу в присутствии лиганда.

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

Принцип аффинного электрофореза может быть использован не только для определения /констант диссоциации комплексов белков со связанными лигандами, но также и для определения констант диссоциации комплексов со свободными лигандами. Подвижность белковой зоны при электрофорезе на аффинном носителе иовышается в зависимости от концентрации свободного специфического лиганда. Таким образом были определены константы диссоциации комплексов лектин —сахар [64]. [c.168]

Найдено, что почти во всех случаях Ki ниже (з 5—10 раз), чем К, для того же свободного сахара, что, очевидно, является следствием того, что исследованные лектины имеют более одного связывающего центра. Используя аффинный электрофорез, можно определять относительно высокие константы диссоциации (например, для взаимодействия одного из изолектинов сыворотки крови угря с L-фукозой найдена константа диссоциации К= = 2-10-2 моль/л). Теоретически можно изучать также взаимодействия, по крайней мере в десятки раз более сла бые. [c.169]

Недавно был описан принципиально новый метод избирательного разделения полинуклеотидов аффинный электрофорез в геле [1011]. Полиакриламидные гели, содержащие поли-(1-винилурацил) или поли-(9-виниладенин) были получены путем полимеризации акриламида в присутствии указанных веществ. При электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот в таких гелях важную роль играют спаривание оснований и более слабые стэкинг-взаимодействия. [c.379]

Второй способ, который дает хорошие результаты, заключается в иммобилизации, или включении, лиганда в носитель для электрофореза, например в гель или стабилизирующий порошок, используемый в электрофоретическом канале. Этот способ аналогичен широко применяемому аналитическому методу ракетного иммуноэлектрофореза. Второй способ проведения. .аффинного электрофореза существует в нескольких вариантах 140—142], в том числе в препаративном в этом случае иммо- [c.224]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология