Аффинные методы разделения

В заключение следует отметить, что аффинные методы разделения в ряде случаев оказываются более эффективными для решения задач, в принципе доступных традиционным методам, поскольку позволяют уменьшить число стадий, а в отдельных случаях провести выделение необходимого компонента в одну стадию. [c.248]

Идея методов разделения белков, основанная на сродстве молекул, которое обнаружено в биологических системах, известна несколько десятилетий (с тех пор, как стали привязывать ферменты к нерастворимым носителям). Нерастворимые гетерогенные катализаторы имеют определенные преимущества легкость выделения из реакционной смеси, возможность осуществления непрерывного катализа и повышение стабильности ферментов. Тем не менее по ряду причин полного развития аффинная хроматография и связывание ферментов с нерастворимыми носителями достигли лишь в последние годы. Развитие обоих направлений началось с использования высокопористых гидрофильных носителей, главным образом агарозы, после разработки подходящих методов связывания (Аксен и др. [1], Порат и др. [32]). [c.10]

Аффинное фракционирование клеток наиболее часто применяется в анализе популяций лимфоидных клеток. Мэтьюз и др. [36] разработали метод разделения лимфоидных клеток из селезенки и тимуса крысы и селезенки мыши на сефарозе с прикрепленным к ней агрегированным иммуноглобулином крысы. [c.135]

Поэтому постоянно велись и ведутся поиски новых, более совершенных методов разделения. В частности, различная адсорбционная способность даже очень близких по структуре соединений используется в адсорбционной хроматографии. Методы противоточного распределения, бумажной и жидко-жидкостной хроматографии основаны на различной растворимости компонентов смесей в двух несмешивающихся жидкостях. Различная растворимость газов в соответствующей жидкости и различная сорбция их твердыми носителями использованы при разработке методов газовой хроматографии. Различие электрических зарядов или констант электролитической диссоциации позволило разработать методы электромиграции (электрофореза) и ионообменной хроматографии. Наконец, самое новое направление, в котором используются специфические биохимические взаимодействия, по-видимому, позволит проводить избирательное выделение веществ посредством аффинной хроматографии. В результате разработки каждого из перечисленных направлений были созданы современные специализированные методы разделения, и цель настоящей книги познакомить с ними читателя. [c.12]

Как уже говорилось в начале разд. 1.2, в основе различных хроматографических методов лежит различие в сродстве. В историческом введении (разд. 1.1) указывалось, что название аффинная хроматография было предложено для относительно нового и эффективного хроматографического метода, в котором сродство играет особенно важную роль. Это обстоятельство, а также отсутствие более подходящего названия привело к тому, что указанный термин быстро стал общепринятым, хотя в принципе против применения здесь слова хроматография можно возражать. В ряде случаев аффинной хроматографией называют методику, в которой в действительности имеют место избирательная сорбция и десорбция , а хроматографический процесс как таковой отсутствует (см. разд. 1.2). Этот пример не единичен. Ряд специальных методов разделения не укладывается в рамки общей схемы, и тем не менее их все-таки называют хроматографическими. Все сказанное подтверждает, что необходима простая и практическая терминология, пусть даже не идеально точная. [c.26]

В хроматографии и родственных методах разделения используются различные процессы распределения веществ между двумя фазами, многократно повторяющиеся в элементарных пространствах [17, 21, 23]. Поэтому такие виды хроматографии, как ионообменная, распределительная, адсорбционная, аффинная и гель-проникающая, основанные на различиях в самых разных свойствах разделяемых веществ, можно проводить с помощью однотипного лабораторного оборудования. [c.191]

Прочие методы разделения. Здесь следует назвать прежде всего аффинную хроматографию, которая обсуждается в гл. 5. [c.50]

Выделение клеток с флуоресцентными активированными клеточными сортерами (ФАКС) требует дорогостоящего оборудования и малопригодно для рутинных экспериментов, особенно при необходимости получения большого числа клеток. Следовательно, существует необходимость в более широко доступных и воспроизводимых методах разделения клеток. Аффинная хроматография в принципе представляет собой идеальный метод для очистки клеток он заключается в иммобилизации на твердых носителях лигандов, избирательно узнающих компоненты мембран. [c.243]

Весьма эффективный метод разделения и очистки белковых и небелковых веществ основан на взаимодействии антигенов и антител. Разработанный на основании таких взаимодействий способ получил название имунно-аффинной хроматографии, который существенно повысил разрешающую способность при введении в практику использования моноклональных антител. Блестящей иллюстрацией его [c.72]

Нафталиновое кольцо выступает в роли прокладки между поверхностью твердофазного носителя и акцептором. Таким образом удалось ковалентно закрепить оптически чистый акцептор на силикагеле и полученный твердофазный носитель использовать для разделения солей первичных аминов и аминоэфиров с помощью жидкостной хроматографии. Такой метод можно назвать аффинной хроматографией, специфичной к энантио-мерам. [c.272]

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Адсорбционную хроматографию на угле, крахмале и других классических сорбентах вообще не применяют для разделения пептидов. Этот метод представлен здесь аффинной хроматографией, основанной на биоспецифической сорбции. Правда, аффинную хроматографию в основном применяют при выделении белков, однако метод может оказаться полезным при изучении физиологически активных пептидов. [c.390]

Концентрация подлежащего выделению вещества в растворе влияет по-разному в зависимости от того, происходит ли аффинное разделение в колонке или в статических условиях (одноразовый метод). Другим важным фактором является степень аффинности взаимодействий комплементарных участков выделяемого вещества [c.81]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных методов разделения (от англ. affinity — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентов. Специфические лиганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинной хроматографии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде. Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособными группами, который по усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствующего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакционноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромци-ансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную ВгС , который реагирует с гидроксигруппой сефарозы, превращая ее в остаток цианата [c.246]

Выделение. Одии из первых этапов выделения Б,-получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Ь переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (N 14)2804], этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С) с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, иапр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. илн группы гомологичных Б. Наиб, распространенные методы разделения-гель-про-никающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. [c.250]

Возрастающая важность микропрепаративной ЖХ как средства очистки биологически важных макромолекул делает, однако, необходимым создание средства для провеления крупномасштабных разделений в условиях непрерывного градиента. Это особенно справедливо для новых разделений, в основе которых лежат гидрофобные или смешанные взаимодействия и используются высокоэффективные подвижные фазы. Классические ионнобменные, ситовые (гельпроникающие) и аффинные методы, традиционно применяемые в колонках большого диаметра при низком давлении, и подача растворителя за счет гравитационных сил могут быть быстро вытеснены современными методами, когда станут доступны подходящие материалы и оборудование. Новейшие приборы для ЖХ открывают хорошие перспективы использования в дальнейшем градиентных разделений в крупном масштабе. Однако в настоящее время опыт работы с такими системами очень ограничен. [c.69]

Использование ступенчатых градиентов. Как отмечено в разд. 1.2.3 и на рис. 1.3, препаративную ЖХ можно использовать как быстрое средство выделения или обогащения классов соединений в условиях ступенчатого градиента. Иногда для простых смесей на этом может быть закончена необходимая очистка (см. пример на рис. 1.27). В других случаях для разделения сложного образца с компонентами, сильно отличающимися по полярности, может быть необходимо использовать многоступенчатую последовательность. Если оставить в стороне вопросы, связанные с растворимостью образца (см. разд. 1.6.2.2.6), то в адсорбционной ЖХ с помощью комбинации только четырех растворителей можно создать последовательность восьми градиентных ступеней и быстро разделить образец на фракции, которые затем можно индивидуально очистить в изократическом режиме. В каждой фракции спектр компонентов будет перекрывать диапазон к примерно только на 5—10 единиц. При скорости 1 мертвый объем в минуту процесс разделения, показанный в табл. 1.8, потенциально может быть закончен менее чем за 20 мин. Размер колонки может быть выбран в соответствии с имеющимся в наличии образцом. Для быстрого фракционирования образца можно аналогичным образом достаточно эффективно использовать градиентные схемы и в других методах разделения (ионный обмен, аффинная хроматография, распределение и т.д.). Классическая колоночная хроматография на открытых колонках часто выполнялась с использованием ступенчатого градиента, создаваемого элюотроп-ным рядом, подходящим для используемой неподвижной фазы. Однако, поскольку приготовление хорошей препаративной ЖХ-колонки требовало искусства и длительного времени. [c.100]

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

Сопоставляя методы разделения высокомолекулярных веществ, следует отметить, что успехи гельпроникающего хроматографического анализа высокомолекулярных веществ существенно снизили значение осадочной хроматографии, которая одно время вызывала пристальное внимание в связи с трудностями осуществления сорбционной хроматографии макромолекул. При оценке нерсиек-тивности аффинной хроматографии следует иметь в виду, что ее специфичность направлена только на один компонент (реже — несколько компонентов), и поэтому ана.питические возможности [c.10]

Очистка высокомолекулярных биологических соединений методом аффинной хроматографии основана на уникальном свойстве макромолекул — их биологической специфичности. Именно благодаря этой особенности с помощью аффинной хроматографии теоретически можно получать абсолютно чистые вещества в отличие от таких методов разделения, как проникающая хроматография и электрофорез, основанных на физико-химических свойствах макромолекул (которые у отдельнь х молекул могут быть практически одинаковыми). [c.100]

К сожалению, многообразие различных сочетаний компонентов в бинарных и более сложных смесях, с которыми встречаются инлгенеры при решении конкретных задач газоразделенпя, не позволяет дать исчерпывающий материал по адсорбционному равновесию, необходимый для расчета технологического процесса. Работы теоретического плана пе дают простого и универсального метода выч1юления меры избирательности адсорбции — коэффициента разделения. Между тем избирательные свойства адсорбентов проявляются уже в результате сравнения изменения энергии компонентов в процессе фазового перехода. Это сравнение в теории объемного заполнения микропор находит количественную характеристику в виде коэффициента аффинности р. Значения Р установлены для большинства компонентов промышленных газов [8, 9]. [c.157]

Метод определения коэффициента разделения по отношению коэффициентов аффинности не претендует на высокую точность. Однако формула (5.28) пригодна Д.Т1Я количественной оценки избирательности адсорбции в технологических расчетах, если отсутствуют данные по адсорбционному равновесию смеси. Достаточная надежность формулы подтверждается небольшим абсолютным значением первого слагаемого правой части (0,23), так как для смеси веш еств с совпада-юш иы11 коэффициентами аффинности (Рх = Рз) логарифм коэффициента разделения должен быть равен нулю. [c.159]

Б случае иммуноэлектрофореза [49 — 51] принцип электрофореза сочетается с биоспецифической аффинностью белка (рис. 3-5). Белки-антигены сначала разделяются гель-электрофоретически. При встрече с диффундированными внутрь геля антителами происходит образование комплексов антиген — антитело, наблюдаемых в виде серповидных полос преципитации. Иммуноэлектрофорез имеет особое значение в медицинской диагностике (разделение и идентификация сывороточных белков и др.). Рис. 3-6 поясняет эффективность этого метода по сравнению с другими видами электрофореза. [c.352]

Хроматографические методы, в которых разделение компонентов смеси основано на различии в размерах, форме или суммарном заряде молекул, часто недостаточно эффективны для разделения смесей белков. В таких случаях может оказаться полезной аффинная хроматография [48]. Успех метода зависит от того, удастся ли найти вещество, которое будет специфически взаимодействовать с подлежащим очистке белком. Для фермента таким веществом может быть конкурентный ингибитор катализируемой этим ферментом реакции, а для участвующего в гормональной регуляции белка-рецептора — соответствующий гормон. Это вещество связывают с подходящим нерастворимым гидрофильным носителем, и полученный материал используют при хроматографии как стационарную фазу. Вещества такого типа часто сами оказываются большими природными макромолекулами, и приемы, используемые для соединения их с носителями, сходны с методами приготовления иммобилизованных ферментов [см. разд. 27.4.2 (5)]. Реакции, с помощью которых белки, содержащие аминогруппы или фенольные группировки, могут быть связаны с носителем на основе сшитого полиакриламида, содержащего некоторое число гидразидных или 4-аминоанилидных остатков (схемы 30, 31 Б — остаток белка). Хорошие результаты получены в тех случаях, [c.322]

Аффиная хроматография является самостоятельной областью жидкостно-адсорбционной хроматографии, выделяемой по специфическому механизму взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом. Метод основан на характерной особенности биологически активньгх веществ селективно и обратимо связывать определенные вещества, называемые аффинными лигандами или аффиантами. Таким образом, ферменты связывают соответствующие ингибиторы, антитела — антигены, гормоны — их рецепторы и т.п. Если по аналогии с обращенными фазами приготовить сорбенты с привитыми аффинными лигандами, появляется возможность селективного хроматографического выделения близких по свойствам биологически активных соединений и их разделения между собой. Наиболее часто применяемые аффинные лиганды приведены в табл. 3.65. [c.201]

Хроматография — совокупность методов и процессов разделения, анализа и физико-химических исследований смесей растворенных веществ, где используются разделяющая среда (неподвижная фаза) и какой-либо растворитель (подвижная фаза). Основана на различии в скоростях перемещения концентрационных зон исследуемых компонентов в потоке подвижной фазы относительно слоя неподвижной фазы. Обязательным и необходимым условием хроматографического разделения компонентов смесей является различие в равновесном и кинетическом распределениях этих компонентов между фазами, адсорбционная X. — вид хроматофафии, основанный на различной избирательной сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом аффинная X. (биоаффинная X., биоспецифическая X., хроматография по сродству) — метод хроматографии, основанный на специфическом взаимодействии разделяемых биологически активных соединений с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимыми носителями [c.343]

Согласно Катрекасасу [71], аффинная хроматография представляет собой метод выделения вещества или группы веществ на основании сродства к какому-либо лиганду, причем это сродство отражает биологические функции исследуемого вещества. В общем виде этот метод был рассмотрен в гл. 7. Поскольку выделению ферментов посвящена гл. 36, в этом разделе мы коротко рассмотрим возможность разделения других классов белков, не обладающих ферментативной активностью. [c.453]

Анализ кривых элюир.ования макромолекул, специфически сорбируемых на аффинном сорбенте, является потенциальным аналитическим методом для изучения специфических взаимодействий биополимеров. Кривые элюирования очень близки к изотермам связывания элюируемого вещества с иммобилизованным аффинантом, и, следовательно, из хроматограммы можно получить термодинамические параметры молекулярных взаимодействий. Метод эквивалентен повторяющемуся диа-лизу и имеет много преимуществ по сравнению с обычным равновесным диализом. Например, он требует намного более низких концентраций и небольших количеств образца, несколько образцов разных молекул можно наносить одновременно и обнаруживать небольшие различия в связывающих способностях при хорошем разделении. [c.55]

В работе Олсона и др. [1] при разделении ферментов и антигенов аффинной хроматографией. применялись методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую отличают использование небольших колонок, высоких скоростей разделения, связанных с этим высоких давлений в системе и, что наиболее существенно, относительно небольших количеств анализируемых веществ. Носителем для иммобилизации аффинных лигандов служил силикагель, поскольку получаемые аффинные сорбенты на этом носителе могут работать в условиях высокого давления. Наиболее ярким примером эффективности такого метода служит разделение в течение 5 мин Н4 и М4 изозимов лактатдегидрогеназы на колонке с №-(6-аминогексил)-АМР—силикагелем в градиенте NADH. [c.452]