Белки неспецифическая сорбция

С увеличением исходной концентрации белкового лиганда абсолютное количество связавшегося материала медленно увеличивается, но доля связывания снижается ввиду стерических помех, которые создают друг для друга крупные молекулы белка при связывании с близко расположенными активными центрами матрицы. Кроме того, излишне высокая исходная концентрация лиганда стимулирует повышенный уровень неспецифической сорбции, что снижает избирательность сорбента. [c.376]

Нативная сефароза или сефароза, блокированная этанолами-ном сразу же после активации бромцианом, не адсорбируют белки [16]. Однако, если сефароза не блокирована тотчас же после активации, наблюдается неспецифическая сорбция белков, которая становится тем сильнее, чем больше проходит времени между активацией бромцианом и блокированием активных центров. Препарат человеческий сывороточный альбумин—сефароза, блокированный после 12 ч после присоединения сывороточного альбумина,, сорбирует только 0,4 мг белка на 1 мл геля. [c.277]

Раствор БСА используется так же, как и Твин-20, для уменьшения неспецифической сорбции белков. [c.116]

Фракционирование удалось улучшить также при использовании колонок с однородными по размеру пор крупнопористыми частицами. Это особенно важно при фракционировании белков, так как при этом устраняется эффект расширения зон крупных молекул (из-за гетерогенности размеров пор) и можно использовать более низкие давления. Возможность получения носителей с порами одинаковых размеров, обладающих низкой неспецифической сорбцией, обеспечивает прочную основу для ГП-ВЖХ. [c.137]

Поверхность закрывают гидрофильными группами (ПЭГ) для минимизации неспецифической сорбции белков на полученной поверхности. [c.253]

Реакция иодирования идет практически мгновенно. Между тем, Na I (из-за интенсивной радиации и возможных примесей) и Хлорамин Т (как сильный окислитель) представляют опасность для нативности белка, поэтому контакт белка с ними должен быть сведен к минимуму. Вслед за Хлорамином Т в пробирку добавляют 100 мкл раствора тиосульфата натрия. Этот сильный восстановитель нацело блокирует оставшуюся окислительную способность Хлорамина Т. Затем реакционную смесь дополняют до 1 мл раствором Nal или KI. Назначение этой операции — конкурентное вытеснение I из мест его неспецифической сорбции. [c.237]

Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результате чего полосы расплываются с образованием хвостов . [c.18]

В данном случае число остатков о-дианизидина, связанных с белком, после хроматографии не изменяется, что свидетельствует об отсутствии неспецифической сорбции о-дианизидина на белке. Методом гель-хроматографии на сефадексе G-100 мы показали, что модифицированная о-дианизидином и ЕОР-карбодиимидом пероксидаза не содержит межмолекулярных сшивок, в то время как при использовании в качестве нуклеофилов других диаминов образовывалось до 20% димеров фермента. [c.115]

Изотерма неспецифической адсорбции характеризует сорбцию белков на неспецифических участках матрицы и на молекулах уже сорбированного белка. [c.63]

Этот выбор диктуется в основном стремлением сохранить нативность очищаемого белка и максимально уменьшить неспецифическую сорбцию других компонентов исходной смеси. Само аффинное связывание вещества с лигандом, как правило, от состава буфера я ид-кой фазы зависит мало. Интересами сохранения нативности и растворимости белка диктуются выбор pH, наличие соли, а иногда (например, для белков мебран) введение в буфер добавок органических растворителей или детергентов. Все это определяется известными свойствами данного белка. Неспецифическая сорбция примесей, в частности балластных белков, на матрице и спейсерах происходит за счет тех же самых сил (притяжения разноименно заряженных групп, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), которые обусловливают и биоспецифическое снизывание вещества с лигандом. Избирательность и прочность аффинной связи обусловлены кооперативным действием различных сил в области связывания, где они дополняют друг друга. Благодаря такой кооперации имеется возможность ввести в буфер факторы, ослабляющие действие сил какого-либо типа или даже всех их одновременно, но в такой степени, что биоспецифическое аффинное взаимодействие будет ослаблено лишь частично, в то время как неспецифическую сорбцию удастся подавить практически полностью. [c.404]

Далее следует сделать выбор между аниона- и катионообменни-ком. При фракционировании определенным образом заряженных молекул такой выбор не представляет труда. Например, очевидно, что олигонуклеотиды следует делить на анионообменнике, а заведомо щелочные белки, например гистоны,— на катпонообменнике. Для амфотерных молекул посредством выбора pH буфера можно задавать знак суммарного заряда и таким образом определять нужный тип ионообменника. Здесь решающим соображением может оказаться учет диапазона pH, в котором препарат (например, белок) сохраняет свою нативность, не склонен к агрегации или неспецифической сорбции. Если такой диапазон pH располагается по обе стороны от изоэлектрической точки очищаемого компонента исходной смеси, то выбор типа обменника может диктоваться оптимизацией условий разделения, как было пояснено выше, в разделе Хроматографический процесс . [c.287]

Из рис. 134, А видно, что за 30 мин высокая степень связывания лактатдегидрогеназы на 5 -АМР-сефарозе достигается лишь начиная с исходной концентрации фермента 1 ед./мл (2 мкг/мл, если считать, что активность фермента составляет ориентировочно 500 ед./мг). Дальнейший ход зависимости полноты связывания от концентрации фермента имеет пологий характер. Процесс связывания фермента при малой его концентрации сильно растягивается во времени (рис. 134, В). Даже при исходной концентрации 0,1 ед./мл связать фермент полностью удается лишь за 16 ч. Очевидно, что такое замедление нельзя объяснить с чисто кинетических позиций соотношения концентрации реагентов (в растворе). Возможно, что имеет место временное задерживание диффундирующих молекул на местах неспецифической сорбции. Свой вклад дает и замедление диффузии белков внутри гранул за счет столкновений с сеткой матргщы. [c.402]

Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упомина.лось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. В таком случае следует элюцию вести в свободном объеме, промывая сорбент на фильтре (с периодическим перемешиванием). Заметим, что промывку сорбента в объеме выгоднее вести несколько раз небольшими пори иями элюента, чем сразу большим его объемом. Аффинная хроматография в свободном объеме удобнее, чем колоночная, и в том случае, когда нужный белок очень мало представлен в неочищенном экстракте, но хорошо связывается сорбентом. Хроматография в объеме позволяет использовать такую концентрацию суммарного белка в экстракте, с которой из-за вязкости было бы трудно работать на колонке. Аффинная сорбция в объеме широко ис1ю.1гьзуется в радио-иммунных методах исследования. [c.409]

Пористое стекло (диаметр пор 5 — 250 нм), как и наиболее широко применяемые носители иа основе агарозы, отличается низкой неспецифической сорбцией и высокой емкостью. Аффинная хроматография нашла широкое применение при разделении ферментов, полнпептидных и белковых гормонов, антител, антигенов, а также транспортных и рецепторных белков. [c.354]

Преимуществами метода Касаи и Ишии [10] являются его чувствительность и простота для исследования необходимо лишь небольшое количество белка по сравнению с методом Данна и Чейкена [7] в этом методе концентрация фермента очень мала относительно Кй использование фронтального анализа упрощает выведенные уравнения объемы элюирования можно определить более точно, поскольку они практически не зависят от концентрации. При использовании этого метода для определения констант диссоциации химотрипсина на сфероне, к которому был привязан с помощью гидрофобного гексаметилендиамина N-бензилоксикар-бонилглицил- D-фенилаланин, Туркова и др. [15] встретились с трудностями, обусловленными, очевидно, неспецифической сорбцией. [c.54]

Привязка аффинанта к нерастворимому носителю в определенной мере сказывается на константе равновесия К - Увеличение К обусловлено модификацией аффинанта связыванием с матрицей, следствием чего является ограничение стерической доступности аффинанта. Напротив, уменьшение К вызывается неспецифической сорбцией фермента на нерастворимом носителе и на уже сорбированном ферменте. Если предположить, что в неочищенном препарате белка только один фермент имеет сродство к матрице, равновесие между привязанным аффинантом и выделяемым ферментом можно выразить следующим образом [c.62]

Для успешного выделения фермента с помощью аффинной хроматографии необходимы очень низкие значения К[ или Кь- Обе константы должны быть много меньше, чем любая константа диссоциации для неспецифической сорбции белка на поверхности матрицы. Максимум для Кь может быть оценен следующим образом. Исходя из концентрации ингибитора в нерастворимом аф-финанте, равной 10" моль/л, и требования 99%-ного связывания фермента при хроматографии неочищенного материала, содержащего 10 моль/л фермента в объеме, равном тройному объему нерастворимого аффинанта, в качестве верхнего предела для Кх получают значение 10 моль/л. В 3%-ном растворе белка, содержащем активный фермент с молекулярной массой 10 в количестве [c.62]

Адсорбционная энергия для неспецифической сорбции АОнеспец складывается из энергии гидрофобных, гидрофильных или даже ионных взаимодействий и сопоставима с адсорбционной энергией в обычной хроматографии. Она очень сильно зависит от природы нерастворимого носителя и белка. ДОнеспец должна быть по возможности низкой, потому что она включает также сорбцию молекул, которые образуют неспецифические комплексы с аффинантом. [c.63]

Работы О Карра и др. [26] показали, однако, что наиболее часто причиной мнимой аффинности систем является неспецифическая сорбция на незаряженной пространственной группе или даже не-биоспецифнческая сорбция белков, обусловленная гидрофобными взаимодействиями. При близком рассмотрении становится очевидным, что эти гидрофобные взаимодействия могут быть полезны для разделения многих веществ для этого типа хроматографии [c.95]

Оптимальные условия связывания, pH, состав буферного раствора и температура, в значительной степени зависят от характера аффинного лиганда. Наиболее эффективно реакция проходит при pH 8—10, однако, если этого требует природа аффинного лиганда, можно использовать и более низкие значения pH. Аффинный лиганд, особенно белковой природы, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5), чтобы предотвратить неспецифическую сорбцию, например белка на белке, которая обусловлена полиэлектролитной природой белков. Для последующей отмывки сорбента используются растворы с более высокой ионной силой. Можно применять карбонатные или бо- ратные буферы с добавкой хлорида натрия. Количество присоединенного лиганда зависит от соотношения в реакционной смеси аффинного лиганда и объема геля, pH, природы самого лиганда (числа реакционноспособных групп и т. д.), а также от длительности проведения реакции и температуры. Например, при иммобилизации химотрипсина к 2 мл NBr-акти Вированной сефарозы при pH 8 присоединяется только 5 мг из 10 мг взятого белка, из 20 мг белка связывается примерно 8 мг, а из 30 мг — примерно 10 мг. При комнатной температуре (20— 25 °С) связывание обычно завершается за 2 ч, при пониженной температуре рекомендуется увеличить длительность реакции до 16 ч, т. е. оставлять реакционную смесь на ночь. В процессе связывания реакционную массу необходимо перемешивать, но применять магнитную мешалку не рекомендуется, так как при таком перемешивании можно разрушить гель. Лучше всего перемешивать реакционную смесь встряхиванием. Когда реакция закончится, гель переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же буферным раствором, в котором проводилось связывание. Оставшиеся активные группы рекомендуется блокировать, с этой целью гель обрабатывают 2 ч 1М этанола-мином при pH 8. Конечный продукт следует промыть 4—5 раз буферным раствором с высоким или низким pH. Например, можно использовать ацетатный (0,1 М, pH 4) или боратный буферный (0,1 М, pH 8,5) раствор, содержащий 1 моль/л хлорида натрия. Как уже упоминалось во введении, все нековалентно связанные соединения следует отмыть. [c.20]

Развиваемые ныне эфферентные методы лечения некоторых заболеваний основаны на гемосорбции или лимфосорбции. Носители сорбирующих колонок содержат более или менее специфические соединения, способные к связыванию токсинов, находящихся в организме. В некоторых случаях оправдано применение твердых носителей, содержащих ферменты. Основное требование к ним — они не должны вызывать деформацию форменных элементов крови. Носителями в данном случае являются сферические частицы из полимеров, стекла, керамики, силикатов. Модификация таких носителей для придания им групп, связывающих белки, проводится методами, заставляющими вступать в реакции ОН-группы носителей. Исходный материал для матрицы должен выбираться таким, чтобы наблюдалась минимальная неспецифическая сорбция. Носитель, как и лиганд, не должен иметь высокую стоимость, поскольку колонки для гемодиализа и детоксикации одноразового пользования. [c.125]

Неспецифическая сорбция. Этот недостаток связан со способом активации. Обработка бромоцианом приводит к активации множества гидроксильных групп, однако не все они доступны для молекул лиганда. Избыточные гидроксильные группы инактивируют избытком первичного амина, лизина, этилен-диамина. Несмотря на это, может иметь место неспецифическое связывание. Нековалентная сорбция наблюдается также при нанесении на колонку концентрированных растворов белков, например сывороток, экстрактов клеток или семян. Для уменьшения неспецифической сорбции рекомендуется промывать сорбент концентрированными солевыми растворами, однако это может привести к десорбции белков, имеющих низкое сродство к лиганду, [c.183]

Как правило, выделение и очистку мембранных белков проводят в присутствии детергентов. Присутствие дигитоннна или додецилсульфата натрия в небольших концентрациях не влияет на эффективность аффинной хроматографии. Однако в каждом конкретном случае необходимо учитывать влияние детергента на процесс сорбции, элюирования и особенно на метод определения биологической активности, применяемый до нанесения образца на колонку. Использование буферных растворов, не содержащих детергентов, может привести к неспецифической сорбции белка на сорбенте вследствие его агрегации, что существенно повлияет на степень очистки. [c.185]

Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена —Fab-фрагментом. Обусловлено это прежде всего тем, что рс-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов. [c.155]

Изучению механизма адсорбции биополимеров на различных поверхностях посвящено огромное число экспериментальных и теоретических работ и написано значительное количество обзорной литературы и книг. Для ознакомления с последними достижениями в данной области см. [518-521]. Несмотря на интенсивные исследования в силу исключительной сложности процесса многие аспекты механизма адсорбции белков являются спорными и не вполне разрешенными. Согласно общепринятым представлениям [515], начальными процессами неспецифической сорбции белков являются гидрофобные взаимодействия между поверхностью и гидрофобными участками белка. Первичная адсорбция в значительной степени обратима и связь белка с поверхностью несильная. Однако вслед за первичной адсорбцией может последовать частичная денатурация и разворачивание белковой глобулы, что приводит к увеличению силы взаимодействия белка с поверхностью и необратимости адсорбции. Для реальных биологических жидкостей, содержащих сотни белков и других веществ, ситуация значительно усложняется благодаря конкурентным адсорбционным и постадсорбционным взаимодействиями, что усложняет исследование и описание происходящих процессов. [c.497]

После промывки обменник переводят в 0,1 М раствор КаНСОз (pH 8,3) с 0,5 М Na L Высокое содержание соли препятствует неспецифической сорбции белков на матрице сефарозы. В этом растворе обменник в течение 2 ч переме шивают с раствором антигена на качал се прн комнатной температуре (или в течение ночи на холоду). Пользоваться для этой цели мешалками не следует ввиду истирания сефарозы. После окончания посадки антигена необходимо за- блокировать не занятые им активные центры сорбента. Для этого гель обрабатывают таким же образом в 1 М растворе этаноламина или 0,2 М растворе глицина при pH 8. Затем избытки белка и блокирующего агента надежно отмывают тем же раствором бикарбоната с солью, потом 0,1 М ацетатным буфером (pH 4) с добавкой 0,5 М Na l и снова бикарбонатом. [c.111]

Ранее отмечалось, что ДДС-Na мешает образованию иммунных комплексов. Между тем, в некоторых случаях этот детергент существенно облегчает экстракцию белка, необходим для его растворения или для подавления неспецифической сорбции легко сорбирующегося белка. Все это относится, в частности, к ней-рон-специфичному щелочному белку I из нервной ткани, где он содержится в концентрации меньше 0,001%. Поэтому при исследовании содержания этого белка была предпринята попытка использования КРИМ в присутствии ДДС-Na. Это оказалось возможным при условии, что одновременно в среду вводили пятикратный (против ДДС-Na) избыток нейтрального детергента NP-40. Образующиеся смешанные мицеллы успешно выполняли упомянутые защитные функции и, вместе с тем, не очень сильно снижали способность к образованию иммунных комплексов (рис. 76) [Goelz et al., 1981]. [c.285]

Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из подробно рассмотренных ниже способов, в частности повторной элюцией-из кусочков геля встряхиванием в течение б—12 ч при 37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с 0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя бикарбонат, и растворяют в воде до 0,1 исходного объема. Затем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и промывают 90°/ )-ным ацетоном. В случае необходимости более полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилнзированный, как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объема, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната аммония с 6 М мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции белка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Do-wex 1x2 (200—400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером. Мочевину затем удаляют диализом. [c.65]

При фракционировании очень малых количеств белка может оказаться заметной сорбция их на геле (белки размазьшают-ся по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исходный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Проходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле. [c.47]

Смотреть страницы где упоминается термин Белки неспецифическая сорбция: [c.289] [c.401] [c.425] [c.446] [c.29] [c.24] [c.183] [c.156] [c.245] [c.360] [c.110] [c.124] [c.237] [c.240] [c.274] [c.19] [c.47] [c.190] [c.19] [c.205]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология