Электрофокусирование диапазон

Диапазон pH-, pH 3—10 3—6 5—8 7—10 3—5 4—6 5—7 6—8 7—9 8—10. Амфолиты с более узким диапазоном pH можно приготовить самостоятельно из коммерческих амфолитов на обычной колонке для электрофокусирования (см. разд. 8.2.5.3). Амфолиты поставляются в виде 40%-ного водного раствора в фасовке по 25 мл. [c.304]

Для достижения хорошего разрешения необходимо работать в возможно более узком диапазоне pH. Правда, при фракционировании белков с неизвестными изоточками обычно проводят предварительный опыт в широком диапазоне pH. Электрофокусирование в области pH 1—3 проводят в присутствии смеси кислот [53]. [c.309]

О достижении равновесного состояния при электрофокусировании свидетельствует падение силы тока до постоянной величины. Кроме того, иногда удается увидеть сфокусированные зоны основных компонентов в виде участков с иным преломлением, хорошо заметных на заштрихованном фоне. Однако ни один из этих показателей не говорит об окончании процесса, и обычно целесообразно продолжать фокусирование еще несколько часов. К тому же проведение электролиза сверх необходимого времени не сказывается отрицательно на разрешении. Для создания градиента pH от 3 до 10 при 400 В и 5°С необходимо около 8 часов. Фокусирование зон белков длится дольше. Обычно весь процесс протекает за 24—72 ч. При фокусировании в широком диапазоне pH процес идет быстрее, он ускоряется также при повышении напряжения и температуры. [c.312]

Рис. 7. Прибор для электрофокусирования в и-образной трубке. Препарат гемоглобина фракционировали в правой части трубки. Левая половина содержит уравновешивающий раствор — 4% этаноламина в 40 -ной сахарозе. Внутренний диаметр трубки равен I см, объем—28 мл. Диапазон pH используемых амфолитов 3—10.

Ряд вопросов постановки эксперимента при электрофокусировании в градиенте плотности, такие, как выбор температуры, концентрации и рН-диапазона амфолитов-носителей, сохраняют свое значение и при электрофокусировании в геле. Другие аспекты, свойственные только этому методу, требуют специального разбора. [c.327]

На рис. 12 приведен пример постепенного фокусирования сложной смеси белков, нанесенной на столбик геля с предварительно фокусированными амфолитами с диапазоном pH 3—10. Электрофокусирование завершается примерно через 50 минут, но спектр разделения фактически остается неизменным при бодее длительном электролизе. Для сравнения отметим, что фокусирование того же образца в более узком диапазоне pH, например 5—8, занимает 75 мин. [c.330]

Описанная ситуация особенно легко может возникнуть при использовании смесей амфолитов, обеспечивающих рабочий градиент pH целиком в кислой или щелочной областях, т. е. не перекрывающий нейтральных значений pH. В этих случаях на границе градиента, в зоне перехода от амфолитов к като- или анолиту, pH неизбежно должно пройти через значение 7, так что может образоваться слой чистой воды. Ввиду этого при составлении кислой или щелочной рабочей смеси амфолитов нередко добавляют в небольшой концентрации еще и амфолиты для нейтральной области pH (6—8). Они заполняют участок перехода от рабочего градиента к одному из электролитов. При этом каким-то участком рабочего объема приходится пожертвовать, но если концентрация нейтральной смеси амфолитов невелика, то и участок этот будет небольшим. В последние годы сами фирмы-производители из предосторожности стали добавлять в смеси амфолитов для кислых и щелочных диапазонов pH необходимые количества нейтральных амфолитов, не указывая этого в маркировке смеси. Тем не менее, опасности появления слоя чистой воды не следует упускать из виду, особенно если путем электрофокусирования отбирают амфолиты для более узкого, чем продажный, диапазона значений pH (см. ниже). [c.15]

В этом разделе приводится методика электрофокусирования в градиенте сахарозы в широком диапазоне pH на колонке Вестерберга и Свенссона объемом ПО мл. Полученные таким путем сведения относительно изоточки исследуемого вещества служат обычно исходными данными для постановки более тонкого эксперимента в более пологом градиенте pH и при более высокой напряженности электрического поля. В случае необходимости приведенные здесь условия можно варьировать с учетом рекомендаций, упомянутых в разд. 8.2.5. Полное описание экспериментов по электрофокусированию дано в работе [24]. [c.306]

Предельно узкий диапазон pH доступных амфолитов составляет 2 единицы pH. Работать в диапазоне 0,5 единицы pH рекомендуется с амфолитами, изоточки которых лежат в области от 4 до 9. Это объясняется тем, что сравнительно немногие компоненты смеси имеют изоточки за пределами этой области. АхМ-фолиты-носители с узким диапазоном pH нужно готовить самостоятельно. Для этого ведут обычное электрофокусирование при высокой концентрации амфолитов (4%) и в отсутствие образца. Затем фракционируют содержимое колонки и объединяют фракции с нужным диапазоном pH. Хранят такие амфолиты в замороженном состоянии. Считают, что концентрация амфолитов в препарате составляет 4%, при составлении рабочих растворов [c.309]

Интересный подход при ИЭФ щелочных белков сыворотки был развит недавно Томасом и Ходсом. Его можно назвать двухстадийным процессом ИЭФ. На первой стадии в пластине ПААГ в присутствии 4 М мочевины и 15% глицерина формировали щирокий и нелинейный градиент pH за счет следующей комбинации амфолитов 0,6% pH 9—11+0,4% pH 7—9-Ь0,2% pH 3,5—10. На большую часть пластины геля при этом ложился диапазон pH 8,5—10,5, где и оказывались интересующие авторов щелочные белки. Однако разделялись они плохо, так как основное падение напряжения приходилось на прилегавшую к аноду часть пластины геля, где располагались амфолиты нейтральной области pH, отличающиеся худшей электропроводностью. Туда же собирались и кислые белки сыворотки. Этот процесс занимал 3—4 ч. Для осуществления второй стадии фракционирования примерно треть прилегающей к аноду части геля вместе с находящимися в ней нейтральными амфолитами и кислыми белками отрезали бритвой и отбрасывали. Ленту анода переносили на новый конец геля и возобновляли электрофокусирование. Теперь все напряжение источника ложилось на нужную область pH и осуществлялось эффективное фокусирование щелочных белков [Thomas, Hodes, 1978]. [c.33]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология