ИЭФ в горизонтальных пластинах ПААГ

ИЭФ в ГОРИЗОНТАЛЬНЫХ ПЛАСТИНАХ ПААГ [c.20]

Подготовка н сборка формы для пластины геля, деаэрация смеси мономеров акриламида и амфолитов, добавление персульфата аммония, заливка в форму, полимеризация и извлечение геля из формы — все эти операции производят точно так же, как прн электрофорезе в горизонтальных пластинах ПААГ, за исключением того, что из-за высокой вязкости раствора, содержащего глицерин, деаэрацию следует вести дольше — около 10 мин. Необходимо напомнить, что мономеры акриламида очень токсичны, поэтому надо избегать их попадания на кожу и в дыхательные пути. [c.26]

Соображения, касающиеся состава геля, концентрации и пропорций амфолитов, остаются здесь темн же, что и для горизонтальных пластин ПААГ. Отметим, однако, что опасность эндо- [c.38]

Собранную и уплотненную одним из описанных способов форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-вать —в горизонтальном положении пластин. Это значительно упрощает задачу герметизации формы достаточно оклеить ее по торцам пластин водостойкой липкой лентой, [c.27]

В первой главе подробно описан принцип метода ИЭФ, т. е. характер миграции белков под действием электрического поля в среде с изменяющейся вдоль пути этой миграции величиной pH ( градиент pH ). Достаточно детально рассмотрен и способ образования градиента pH, в частности свойства амфоли-тов — веществ, формирующих этот градиент под действием электрического поля. Такое рассмотрение необходимо для понимания описанных ниже экспериментальных подходов и позволяет сразу же выявить некоторые уязвимые места метода, игнорирование которых может привести к артефактам. Вторая глава посвящена разбору аналитических вариантов ИЭФ, сгруппированных по типу используемых гелей горизонтальные пластины полиакриламидного геля (ПААГ), вертикально стоящие трубки ПААГ и горизонтальные пластины агарозы. В отдельную главу выделен ( вычайно плодотворный аналитический [c.3]

Лиофилизированные суммарные препараты растворяли в 8 М растворе мочевины, содержавшем 3% NP-40 и 10% р-меркаптоэтанола. ИЭФ проводили в горизонтальной пластине 6%-ного ПААГ на приборе Мультифор в смеси, содержавшей 2% амфолинов pH 6—8 и 0,2% амфолинов pH 3,5—10. При полимеризации геля в одном случае добавляли в него до 8 М мочевину, а во втором— еще и NP-40 до концентрации 3%. Во втором варианте разделение полос а-, р- и Y-глобинов улучшалось, но сами эти полосы расщеплялись [Righetti et al, 1979]. [c.25]

Установку пластины геля агарозы в прибор для горизонтального электрофореза, наложение полосок фильтровальной бумаги, пропитанных электролитами, и электродов производят точно так же, как было описано для пластин ПААГ. Отметим только, что в качестве анолитов не следует использовать концентрированные растворы сильных кислот, так как они могут растворять агарозу. Фирма LKB рекомендует для этой цели 0,5 М раствор уксусной кислоты, а фирма Pharma ia —0,05 М раствор серной кислоты. В качестве католита можно употреблять [c.44]

Такую же последовательность разделений использовали для двумерного фракционирования сложной смеси белков фибро-бластов почки хомячка [Тизгупзк е а1., 1979]. Белкн экстрагировали в присутствии 2% ДДС-Ма н фракционировали в первом направлении на пластине толщиной 1,5 мм классическим методом Лэммли с использованием градиента концентрации ПААГ (7—13%). Исходный материал для ИЭФ на втором этапе разделения на этот раз поставляла полоска геля, вырезанная продольно вдоль ПОЛЯ, т. е. один из треков пластины первого направления. Фокусирование, как и в предыдущем случае, проводили в приборе Мультнфор на горизонтальной пластине 4,5%-ного ПААГ в присутствии 8,5 М мочевины и 2,5% МР-40, но в более узком диапазоне pH (5—7). По-вндимому, для более быстрого фракционирования кислых белков авторы накладывали полоску геля первого направления на пластину со стороны катода. Кроме того, равномерность перехода белков из полоски в пластину могла пострадать от того, что концентрация ПААГ менялась от 7 до 13% вдоль полоски. Из-за этих двух обстоя- [c.59]

На строго горизонтальную поверхность пластины ПААГ быстро выливают расплавленный 0,5%-ный раствор агарозы в СФБ, чтобы получить слой толщиной 1 мм. Предварительно агарозу смешивают при 56° с разбавленной специфической антисывороткой. После застывания геля агарозы такую двуслойную пластину выдерживают при 37° во влажной камере 2—6 ч, в зависимости от размера молекул антигена, диффундирующих из ПААГ в агарозу. Затем, отметив на пленке агарозы положение лидирующего красителя в рабочем ПААГ, ее снимают, покачивая пластинку в СФБ. Пленка агарозного геля легко отделяется от ПААГ. Одновременно с диффузией в гель агарозы идет им-мунохимическая реакция антигенов с находящимися в геле антителами и образование преципитатов. Пленку вымачивают в течение 4 ч в том же буфере, удаляя из нее не прореагировавшие иммуноглобулины антисыворотки и белки неантигенной природы, перешедшие туда из ПААГ. Преципитировавшие иммунные комплексы с участием искомого антигена можно окрасить обычными способами или обнаружить методом авторадиографии, если антиген или антитела несут радиоактивную метку. Отметим, что преципитация здесь требует подбора концентраций и довольно значительного времени диффузии антигенов в агарозу для обеспечения эквивалентного соотношения концентраций антител и антигена. [c.129]

Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель размером 30 X 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали на металлический охлаждающий столик самодельного прибора, накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности прижимали к столику давлением наполненной воздухом подушки [Ки1а1е1а(12е а1., 1979]. [c.36]

Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится затруднительным. В этом случае можно силиконировать стекло или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к которому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой концентрации акриламида — вполне надежно. Полимеризацию геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пластиной плексигласа удобно проводить для последующего горизонтального электрофореза. После окончания полимеризации плексиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на охлаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для горизонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое, налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в кй ( ру, заполненную азотом. [c.12]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология