Сахароза, градиент

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. [c.145]

Наиболее широкое применение нашел метод изоэлектрической фокусировки. Он основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента pH, причем значение pH возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещает в том или ином направлении в соответствии со знаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение pH совпадает с его изоэлектрической точкой. На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его заряд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный градиент pH, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналогичен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахарозы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате диффузии белок уходит из участка, на котором pH = р1, в сторону катода, он попадает в область более высоких значений pH и заряжается отрицательно. Под [c.243]

Наконец, на схеме 6 изображена ситуация в момент сбора и фракционирования градиента. Вновь на малой скорости через переходное устройство на периферию ротора подается жидкость, более плотная, чем та, что входит в состав градиента, например 60%-ный раствор сахарозы. Градиент последовательно, от менее плотной до более плотной его части, вытекает через центральный канал. Выносимые им частицы регистрируются [c.195]

Осторожным наслаиванием растворов сахарозы с последовательно уменьшающейся плотностью или центрифугированием растворов, содержащих кроме исследуемых веществ равномерно распределенные по объему пробирки соли цезия или рубидия, можно создать градиент плотности растворителя по высоте пробирки. Центрифугирование в ячейках с градиентом плотности приводит к накоплению вещества в очень узкой области, в которой плотность вещества совпадает с плотностью растворителя. Центрифугирование в градиенте плотности применяется, в частности, при изучении нуклеотидов. [c.157]

В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ [c.172]

Линейный градиент сахарозы 5—20% создают с помощью специального прибора-смесителя, аналогичного изображенному на рис. 14, Л. Готовят одновременно 3 или 6 пробирок по 5 мл и оставляют в холодильнике. Образцы РНК растворяют в Na-ацетатном буфере в концентрации 1—2 мг/мл. Очень медленно и осторожно наслаивают по 0,1— [c.172]

Если поток / и градиент концентрации выражены соответственно в кг/(м -с) и кг/м то коэффициент диффузии будет иметь размерность м7с. В сильно разбавленном водном растворе при 25° С коэффициент диффузии для хлористого калия составляет 1,99-10- ° м /с, а для сахарозы он равен 5,23-10- м /с. Эти значения можно сравнить с соответствующими значениями для некоторых белков, приведенными в разд. 20.8. [c.353]

При 25° С образуется резкая граница между разбавленным водным раствором сахарозы и водой. Через 5 ч стандартное отклонение градиента концентрации составляет 0,434 см. а) Чему равен коэффициент диффузии сахарозы в этих условиях [c.357]

Центрифугирование в градиенте сахарозы [c.335]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

При достаточно большом времени центрифугирования частицы достигают в градиенте плотности равновесных положений. Именно та-[ким образом в соответствии с их плотностью в градиенте сахарозы разделяют клеточные органеллы (гл. 1, разд. Б.6). Макромолекулы (на- [c.163]

Следует также упомянуть метод центрифугирования в градиенте плотности. Обычно работают в возрастающем градиенте плотности сахарозы при высокой скорости ротора. Расстояние, на которое перемещается белок в градиенте, обратно пропорционально его молекулярной массе. Молекулярную массу неизвестного белка с достаточной точностью можно определить, сравнивая его с добавленным стандартным белком известной молекулярной массы. [c.361]

Чаще всего разделяемую смесь наносят на раствор сахарозы, который приготовлен таким образом, что уже в верхнем слое его плотность выше, чем плотность наносимого образца (иначе произошло бы практически мгновенное перемешивание), и постепенно возрастает в направлении к дну пробирки. Наличие градиента концентрации сахарозы существенно ослабляет диффузионное размывание зон, так как если по ходу перемещения зоны какого-либо биополимера часть его в результате диффузии опережает движение основной зоны, то она попадает в область с более высокой плотностью растворителя ро и в соответствии с (7.3) их перемещение затормаживается, а в случае их диффузии в сторону отверстия пробирки по той же причине их движение ускоряется. В обоих случаях частицы, ушедшие из <своей> зоны в результате диффузии, отбрасываются обратно. [c.243]

Существует возможность также очищать растворы неэлектролитов от солей. В этом случае трехкамерный электродиализатор (рис. 3, а) представляет собой соединенные друг с другом узкие и высокие прямоугольные камеры. Очищаемый раствор непрерывно движется через среднюю камеру. При этом наблюдается как перенос ионов, так и потеря очищаемого вещества вследствие диффузии его через мембраны. Однако при градиентах потенциала 250 в см очистка идет н астолько быстро, что эти потери невелики. При очистке растворов происходит сильное перемешивание жидкости из-за ее нагревания. В этом случае перемешение ионов внутри камеры не играет существенной роли. Скорость очистки определяется перемещением ионов в мембране и пристенном слое жидкости. Поэтому существенно падение потенциала на мембране и мембраны следует применять толстые (порядка 0,1—0,2 мм) с большим электрическим и диффузным сопротивлением. Это одновременно увеличивает диффузионные потери, что проверено нами (табл. 9) при очистке растворов сахарозы (градиент потенциала 250 в см). [c.64]

Эти расчеты можно использовать только как самые предварительные, поскольку сразу же после начала центрифугирования на градиент концентрации образца будут влиять по крайней мере два других фактора. Первый из них выявляется в тот момент, когда молекулы РНК проходят через резко выраженную зону, отделяющую сахарозу основного градиента от сахарозы градиента образца. При этом полоса образца суживается, и концентрация его градиента возрастает. Этот эффект будет выражен в меньшей степени, если концентрация сахарозы в поверхностном слое основного градиента будет выше концентрации сахарозы в нижнем слое градиента образца пе более чем па 1—2%. Второй фактор, влияющий на градиент концентрации образца, обусловлен присутствием в большинстве градиептов разных по величине РНК. Но мере отделения быстро седимен-тирующих РНК от медленно седиментирующих молекул РНК градиент концентрации образца будет уменьшаться. Суммарное влияние этих двух факторов предугадать очень трудно. Кроме того, при попытке использовать максимальную емкость того или иного градиента нужно отдавать себе отчет в том, что всякое увеличение высоты слоя наносимого образца не может не привести к ухудшению разделения РНК. Поэтому общий накопленный опыт, а также индивидуальные эксперименты помогут устано-пить в каждом конкретном случае те необходимые предельно допустимые количества РНК, которые можно наносить па сахарозный градиент. [c.134]

Так, для препаративного разделения рибосомных субъединиц в зональный ротор Т1-15 подавали экспоненциальный градиент сахарозы [8урЬег(1, 1гетап, 1974]. В смесителе постоянного объема (700 мл) находился раствор сахарозы с концентрацией 7,4%, а в резервуаре —50%-ный раствор. Объем градиента был небольшим (всего 700 мл), что обеспечивало в роторе диапазон концентраций 7,4—38%. Вместе с подушкой из 45%-ной сахарозы градиент занимал лишь половину объема ротора — слой в [c.275]

Седиментация под влиянием центрифугирования происходит при скорости, зависящей от размера капель эмульсии. Пинтер и Зильвесмит (1962) фракционировали эмульсии М/В по размерам частиц седиментацией в колонке с сахарозой. Они получали слои с различными плотностями. Градиент плотности создавали при смешивании 50 и 30% растворов сахарозы. Смесь помещали в пробирку емкостью 100 и далее вводили 1 мл эмульсии М/В в 50% растворе сахарозы. В нижнюю часть пробирки вводили 5 мл 60% раствора сахарозы. Центрифугирование проводили при скорости до 2800 об1мин. [c.153]

Моно- и ОЛИ ногу клеосомы можно выделить, например, центрифугированием в градиенте сахарозы продуктов расщепления хроматина нуклеазой. Еще более тонкое фракционирование хро-матиновых частиц получают с помощью гель-электрофореза, при котором разделяются нуклеосомы с разной длиной линкера или различающиеся по белковому составу. [c.244]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

Получение рибосом из печени крысы. Навеску ткани гомогенизируют (приготовление препарата см. на с. 49) в гомогенизаторе Поттера в 5-кратном объеме среды выделения следующего состава 0,01 М трис-буфер (pH 7,6), 0,02 М Mg la и 0,05 М сахароза. Гомогенат центрифугируют на холоде при 18 000 в течение 30 мин. Центрифугат сливают в колбу, осадок суспендируют в таком же объеме среды выделения и повторяют гомогенизацию. Гомогенат центрифугируют, осадок отбрасывают, а центрифугат объединяют с первым. Объединенный раствор подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение 90 мин. Осадок рибосом суспендируют в среде, содержащей 0,1 М трис-буфер и 0,001 М Mg la. Если суспензия мутная, ее осветляют центрифугированием на хоМде (18000 g, 15 мин). Очистка фракции рибосом может быть проведена также ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы 10—30% (с. 172). [c.170]

Индивидуальные рРНК в препаративных кол-вах получают из изолнр. субчастиц рибосом или ультрацентрифугированием суммарной РНК в градиенте концентрации сахарозы. Для аналит. целей индивидуальные рРНК м.б. получены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.266]

Элюцию парафинов с колонок проводили высушенным и перегнанным гексаном. Элюат упаривали и наносили на взвешенные стекла для рентгенографического анализа. Массу осадка определяли по разнице масс стекол с осадком и без осадка. В том случае, когда парафин вьщеляли из специализированных мембран мозга (миелин, синаггтосомът), пользовались методикой выделения мембран с помогцью дифференциального цевгтрифугирования в градиенте сахарозы с последующей экстракцией липидов по М. Кейтсу [54] и дополнительной экстракцией липидов и углеводородов в системе гек-сан изопропанол (3 2) [352]. [c.116]

Во многих клетках встречаются микротельца [24, 25], в зеленых листьях их число достигает иногда /з числа митохондрий. Микротельца, по величине близки к митохондриям, но окружены однослойной мембраной и иногда имеют кристаллическую по виду сердцевину ( соге ). Мембрана микротелец проницаема для низкомолекулярных соединений (например, для сахарозы), что позволяет отделить эти органеллы от митохондрий путем центрифугирования в градиенте сахарозы, где микротельца имеют плотность около 1,25 г-см , а непроницаемые для сахарозы митохондрии — 1,19. [c.34]

Для наблюдения скорости диффузиофореза были поставлены опыты [4], схема которых показана на рис. Х.7. Втцубке С С высотой около 10 см создавался вертикальный градиент концентрации сахарозы (или глюкозы), для чего нижний конец трубки сообщался с большим резервуаром В, содержавшим высокую концентрацию сахарозы, а верхний конец — с чистым растворителем в резервуаре А. Растворителем служила смесь воды и метилового спирта такой концентрации, при которой ее плотность была равна 0,97 г/см . В среднюю часть трубки помещались шарики японского воска с плотностью <3,945 г/см и радиусами от 0,1 до 1,5 мм. Вначале, когда весь перепад концентрации сахара был сосредоточен в узкой средней зоне трубки, все шарики независимо от радиуса были сосредоточены на почти одинаковой высоте в этой же зоне. По мере того как шла диффузия и зона переходных концентраций размывалась, устанавливалось определенное распределение шариков по высоте в зависимости ют их радиусов. [c.306]

На конечной стадии очистки некоторые авторы использовали центрифугирование в градиенте сахарозы. Мори и Утсуми [83], как и Кэйзи [17], очищают этим способом легумины соответственно конских бобов и гороха. Однако для аналитических целей чаще применяется ультрацентрифугирование. Этот метод остается ценным средством для проверки чистоты образца и позволяет, кроме того, оценивать размеры молекул [17, 33, 47, 52, 85]. [c.155]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Для биофизики важен метод седиментации в градиенте плотности. В концентрированном растворе низкомолекулярного но-щества (в СзС1, в сахарозе и т. д.) при ультрацентрифугироиа-нии устанавливается градиент концентрации, т. е. градиент плотности растворителя макромолекул фо/йх. В таком растворе мак[)о-молекулы будут располагаться в той части кюветы, в которой 5 = 0, т. е. согласно (3.66), Умро = 1 или ро = рм- Иными словами, макромолекулы локализуются в той области кюветы, где плотность концентрированного раствора совпадает с плотностью макромолекул (р измеряется непосредственно). Гетерогенная смесь макромолекул разделяется и наблюдается спектр плотностей. Этот метод с большой эффективностью применяется при изучении нуклеиновых кислот. [c.82]

Для идентификации гена, кодирующего протоксин, используют обычную методику. В. thuringiensis выращивают в культуре и лизируют клетки. Выделяют суммарную клеточную ДНК и центрифугируют ее в градиенте плотности s l, чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они содержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Это обогащает ту плазмидную фракцию, которая послужит в дальнейшем исходным материалом для идентификации генов протоксинов (рис. 15.3). [c.335]

Ген протоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki находится на одной из семи плазмид длиной 2,0 7,4 7,8 8,2 14,4 45 и 71 т. п. н. Чтобы определить, в какой именно, проводили центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте плотности сахарозы. Были вьщелены три фракции, в кото- [c.335]

Перколл (Pharma ia)-коллоидные частицы силикагеля, покрытые поливинилпирролидоном (ПВП). Содержание ПВП в покрытых частицах 12% 1 ч- 2% свободного ПВП. Средний диаметр покрытых частиц 21 ч- 22 нм (при разбросе 15 30 нм). В отсутствие солей или сахарозы может быть стерилизован автоклавированием при 120°С в течение 20 мин без разложения. Макс. возможная плотность в градиентах 1,30 г/мл. Низкое осмотическое давление. Низкая [c.472]

Важной разновидностью седимеита-ционного метода, получившей широкое применение при исследовании природных полимеров, является центрифугирование в градиенте плотности [3, с. 418]. В центрифужной пробирке создают градиент плотности (например, смёшивая при помоши автоматически действующих насосов водный раствор сахарозы с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях), а затем наслаивают поверх него исследуемый раствор полимера в легком растворителе (рис. 169). [c.544]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология