ДНК-лигаза продукты реакции

Все лигазы катализируют реакции, идущие с участием трех субстратов и дающие три продукта. Во всех изученных случаях процесс идет через две или три стадии, причем первые не требуют участия всех трех субстратов- и поэтому могут изучаться и осуществляться в упрощенной системе. Во всех случаях синтез продукта и гидролиз АТФ проходят сопряженно через некоторый общий промежуточный продукт. [c.152]

ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-лигазы, а также всех остальных необходимых кофакторов и ионов. Реакционную смесь прогревают до температуры, оптимальной для лигирования, после чего между отожженными олигонуклеотидами образуется фосфодиэфирная связь, соединяющая оба олигонуклеотида друг с другом. Затем температуру реакционной смеси повышают до температуры плавления гибрида, образованного анализируемой ДНК и лигированными олигонуклеотидами, которые освобождаются в реакционную смесь в составе единого фрагмента. Во время второго цикла температуру реакционной смеси вновь понижают до температуры отжига олигонуклеотидов, которые, находясь в молярном избытке по отношению к освободившимся продуктам реакции, преимущественно гибридизуются с ДНК. Далее, связавшиеся олигонуклеотиды снова лигируют, и образовавшийся продукт реакции освобождают из гибрида повышением температуры. При этом содержание продукта в реакционной смеси удваивается. После проведения п циклов ЛЦР в реакционной смеси теоретически может оказаться пх молекул продукта реакции, где х - число пар олигонуклеотидов, вступающих в реакцию в каждом цикле, теоретически равное числу копий анализируемой последовательности нуклеотидов в реакционной смеси. [c.242]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Механизм действия лигаз изучен еще недостаточно, но, несомненно, он весьма сложен. В ряде случаев доказано, что одно из участвующих в основной реакции веществ сначала дает промежуточное соединение с фрагментом распадающейся молекулы АТФ, а вслед за этим указанный промежуточный продукт взаимодействует со вторым партнером основной химической реакции с образованием конечного продукта. [c.136]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

ДНК — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизо-вался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу. [c.163]

Систематическое название ферментов шестого класса образуется либо из названия продукта реакции в сочетании со словом синтетаза, либо из названий соединяемых субстратов в сочетании со словом лтаза. В скобках указывается продукт, который образуется в результате сопряженного гидролиза АТФ или ГТФ. Например, аминоацил-тРНК-синтетаза, катализирующая реакцию (IV.41), для случая R, = Н (т. е. когда речь идет о глицине) называется глицил-тРНК синтетаза или глицин тРНК лигаза (образующая АМФ). [c.150]

Рис. 8.7. Внесение случайных мутаций в клонированный ген. Вектор, несущий клонированный ген, расщепляют рестриктазами RE1 и RE2, в результате чего образуются один 3 - и один 5 -укороченные концы (и соответственно один 3 - и один 5 -выступающие концы). Затем его обрабатывают ферментом ЕхоТП, который расщепляет ДНК только с укороченного 3 -конца, удаляя по одному нуклеотиду. Через некоторое время реакцию останавливают и заполняют образовавщийся пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. соИ. При этом в реакционную смесь добавляют все четыре дезоксинуклео-зидтрифосфата (dNTP) и в небольшом количестве -аналог одного из них. Обрабатывают продукт нуклеазой S1 для образования тупых концов, лигируют с помощью ДНК-лигазы Т4 и трансформируют клетки

Более простым, хотя и менее чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Проводят лигирование при 65 °С, затем повышают температуру до 94 °С, чтобы произошла денатурация образовавшихся гибридов зонд-ДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65 °С для гибридизации свободных нелигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНК-мишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если иггдикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплементарны ДНК-мишени, то лигирование будет происходить в каждом цикле, и после 20 циклов накопится достаточно продуктов лигирования ( сшитых зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить с помощью электрофореза или ELISA. Если комплементарность неполная, то лигирование не произойдет и никаких продуктов зарегистрировано не будет. [c.198]

При брожении моносахаридов пивными дрожжами (спиртовом брожении) образуется в качестве побочного продукта небольшое количество левовращающего ацетоина в результате конденсации двух молекул ацетальдегида. Эта реакция приписывается особому ферменту — карбо-лигазе (К. Нейберг, 1922 г.) [c.198]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология