Дитиотреитол

Триэтаноламиновый буфер — 0,05 М раствор, pH 7,6, содержащий 2,0 М сульфат аммония и 1 мМ дитиотреитол. [c.262]

В реактивы 3—9 непосредственно перед началом работы добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 0,2 мМ. [c.275]

Гель-фильтрация. Готовят колонку (20x40 см), заполненную сефадексом 0-75 и уравновешенную 0,1 М сульфатом аммония, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, pH 6,0. На колонку наносят около 2 мл раствора белка и пропускают раствор, используемый для уравновешивания колонки. Анализируют фракции элюата, определяя в них содержание белка и активность фермента. Собирают и объединяют фракции, содержащие наибольшее количество активного белка. Гель-фильтрацию можно повторить на той же колонке с новыми порциями раствора белка. Объединенные элюаты концентрируют путем осаждения белка сульфатом аммония (конечная концентрация — [c.262]

Белок растворяют в таком объеме 40 мМ раствора № I, чтобы конечная концентрация остатков цистеина составляла 1 10 " —4-10 М. К раствору белка добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 1 10 —4-Ю " М и инкубируют 30 мин при 37°С. Далее к раствору белка добавляют раствор ДТНБ, приготовленный на том же буфере, до конечной концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию 5Н-групп белка, и инкубируют 30 мин при 37 °С. Модифицированный белок подвергают цианолизу, добавляя к инкубационной среде водный раствор цианистого калия до конечной концентрации, в 20 раз превышающей концентрацию ДТНБ в инкубационной среде. Полученную смесь инкубируют при 37 °С в течение ночи. При необходимости по окончании инкубации образец можно обессолить на маленькой колонке с сефадексом 0-50, уравновешенной 50—100 мМ бикарбонатом [c.143]

В спектрофотометрическую кювету вносят следующие компоненты (указаны конечные концентрации) 50 мМ трис-НС1, pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 6 мМ Mg( H3 OO)2, 50 мМ КС1, 4 мМ (NH4)2S04, 0,2 мМ НАДН, 1 мМ фруктозо-6-фосфат, 1 мМ АТФ, [c.240]

КР=30 мМ раствор, содержащий 4 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, pH 7,5 (раствор для экстракции). [c.241]

Трис-фосфатный буфер — 50 мМ раствор, pH 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол и 0,2 мМ фруктозо-1,6-дифосфат (буфер А). [c.244]

Сульфат аммония — насыщение 0,5, содержит 5 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитол. [c.255]

Пирофосфат натрия — 50 мМ раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,2 мМ дитиотреитол, pH 8,5. [c.255]

Экстракция. Измельченную мыщечную массу заливают двойным (по весу) объемом экстрагирующего раствора (30 мМ КОН, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол) и гомогенизируют с помощью блендера в течение 1 мин. Полученный гомогенат перемешивают на механической мешалке в течение 15—20 мин. Экстракт отделяют центрифугированием (20 мин при lOOOg ). [c.255]

Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту, (рН 7,0) добавляют при постоянном перемешивании небольшими порциями мелкоизмельченный сульфат аммония (50,5 г на 100 мл раствора). Доводят pH до 7,0—7,5 добавлением концентрированного аммиака. Через 30 мин выпавший осадок удаляют центрифугированием (60 мин при 30 ОООg). Доводят pH раствора до 7,8—8,0 и оставляют на ночь. Кристаллизация начинается сразу и продолжается в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием (60 мин при 30 000g ) и суспендируют в растворе сульфата аммония насыщения 0,5, содержащем 5 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитол. Дальнейшая очистка фермента может проводиться следующими методами. [c.255]

Осадок кристаллов растворяют в 5 мМ растворе ЭДТА с 0,5 мМ дитиотреитолом (pH 7,5) так, чтобы концентрация белка составляла 10—20 мг/мл. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием. К прозрачному раствору медленно, при перемешивании на магнит- [c.255]

Сульфат аммония — 0,1 М раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, pH 6,0. [c.261]

Натрий-фосфатный бус )ер — 0,1 М раствор, pH 7,6, содержащий 10 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол. [c.261]

Триэтаноламиновый буфер — 10 мМ раствор, pH 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол. [c.262]

Экстракция. Измельченную мышечную массу (500 г) (с 221) суспендируют в пяти объемах 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,6), содержащего 10 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол. После 60-минутного перемешивания механической мешалкой суспензию центрифугируют (20 мин при 10 000 ). [c.262]

Тепловая обработка. Около 1/4 всего количества осадка растворяют в 0,05 М триэтаноламиновом буфере, pH 7,6, содержащем 2,0 М сульфат аммония и 1 мМ дитиотреитол, до достижения концентрации белка 40 мг/мл и инкубируют в водяной бане при 50°С в течение 5 мин Затем быстро охлаждают в ледяной бане и денатурировавшие белки удаляют центрифугированием при 15 000 в течение 40 мин. Белок из раствора осаждают добавлением сульфата аммония до 3,2 М концентрации, центрифугируют (40 мин при 15 000 ) и осадок растворяют в 10 мМ ЭДТА, содержащем 1 мМ дитиотреитол (pH 7,6). Проводят диализ против того же раствора. После диализа концентрация белка должна составлять 50—60 мг/мл. Этот раствор используют для дальнейшей очистки фермента. [c.262]

М). Осадок растворяют в небольшом объеме 10 мМ триэтаноламинового буфера, pH 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, и диализуют против того же буфера. [c.262]

Фосфат калия — 30 мМ раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, pH 7,0. [c.263]

Сульфат аммония — насыщенный раствор, содержащий 30 мМ имидазол, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, pH 7,0. [c.263]

Экстракция. Измельченную мышечную массу (с. 291) заливают тремя объемами раствора экстракции 30 мМ фосфата калия, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, pH 7,0, и гомогенизируют 2—3 мин, после чего гомогенат сразу же центрифугируют (30 мин при 10 000g). [c.263]

Фракции, содержащие 3-фосфоглицераткиназу, объединяют и добавляют сухой сульфат аммония, доводя раствор до помутнения. Фермент кристаллизуется в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием и растворяют их в небольшом объеме буфера 30 мМ имидазол, содержащий 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, pH 7,0. Медленным добавлением сухого сульфата аммония доводят раствор до помутнения. Кристаллы хранят в виде суспензии в насыщенном растворе сульфата аммония, содержащем 30 мМ имидазол, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, pH 7,0. [c.264]

Всю работу проводят в холодной комнате. Растворы готовят на бидистиллированной воде, содержащей 5 мМ ЭДТА и 0,2 мМ дитиотреитол, pH 7,0. [c.268]

Экстракция. Мыщечную массу (приготовление см. на с. 221) заливают холодным раствором экстракции 30 мМ фосфат калия, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол, pH 7,2 (соотнощейие веса мыщц к объему раствора экстракции 1 3). Мыщцы гомогенизируют в течение [c.275]

Обессоливание. Все дальнейшие процедуры желательно провести в течение одного дня. Осадок растворяют в минимальном объеме (около 3 мл) буфера следующего состава 0,2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ дитиотреитол (доведено имидазолом до pH 7,2) и наносят на колонку [c.275]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология