Гомогенаты

Первый раздел Практикума должен помочь студентам освоить методические приемы и основы аналитической биохимии. Он содержит описание основных принципов и методов концентрационного анализа, принятых в биохимии (спектрофотометрического, колориметрического, манометрического), в частности, для количественного определения гликогена, глюкозы, неорганического фосфата, фосфорных эфиров углеводов, молочной и пировиноградной кислот. В раздел включены работы, посвященные анаэробному превращению углеводов. Каждая задача, выполняемая студентом, предусматривает анализ чистоты исходного препарата углевода или его фосфорного эфира, получение ферментного препарата (гомогената или экстракта ткани), постановку биохимического эксперимента, количественную оценку результатов. Количественное определение веществ проводится несколькими методами, результаты сопоставляются. Так, выполняя задание по теме Превращение фруктозо-1,6-дифосфата в молочную кислоту , студент анализирует фруктозо-1,6-дифосфат по фруктозе и по фосфату, молочную кислоту определяет спектрофотометрическим и колориметрическим методами. Подобным образом выполняются работы, связанные с превращением других фосфорных эфиров углеводов, гликогена, глюкозы. [c.5]

На примере ряда соединений показана зависимость степени всасывания через кожу от химического строения и физико-химических свойств, влияния таких факторов, как температура, влажность и др. Изучены гистохимические изменения в коже и гидролиз веществ гомогенатом кожи. [c.2]

ГИДРОЛИЗ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ГОМОГЕНАТОМ КОЖИ [c.145]

Ферментативный анаэробный распад углеводов исследуют при инкубации тканевого гомогената или экстракта с субстратами гликолиза (гликогеном, глюкозой, а также с промежуточными продуктами гликолиза). О процессе судят по приросту конечного продукта анаэробного превращения углеводов — лактата или убыли субстратов. Отдельные этапы изучают при добавлении в инкубационную среду ингибиторов ферментов или удалении диализом кофакторов и коферментов, необходимых для определенных реакций процесса анаэробного превращения углеводов. [c.49]

ТАБЛИЦА 16. Гидролиз зарина и его аналогов гомогенатами кожи [c.146]

Химическое соединение спонтанный гомогенат [c.146]

Были поставлены также контрольные пробы с гомогенатом кожи, но без прибавления ФОС. Эти опыты показали, что сам гомогенат кожи может давать определенное количество кислоты, но оно сравнительно невелико и заметно не изменяет pH среды. Это количество кислоты может быть оттитровано и затем учтено при подсчетах образовавшейся кислоты из действующих веществ. [c.148]

Рис. 34. Кривые спонтанного гидролиза (I) и гидролиза в присутствии гомогената кожи (2) фосфамида.

В табл. 17 приведены константы спонтанного гидролиза и гидролиза в присутствии гомогената кожи в буферной системе с добавлением диоксана, а также периоды полураспада изучен- [c.150]

ТАБЛИЦА 17. Константы (К) и периоды полураспада (<7.) спонтанного гидролиза и гидролиза некоторых ФОИ в присутствии гомогената кожи [c.150]

Результаты проведенных исследований свидетельствуют также о том, что в присутствии гомогената кожи гидролиз веществ протекает значительно быстрее константы ферментативного гидролиза для всех соединений выше, а периоды полураспада короче, по сравнению с соответствующими величинами при спонтанном гидролизе. Следователь- [c.151]

Рис. 33. кривые спонтанного гидролиза (/) и гидролиза в присутствии гомогената кожи крысы (2) препарата М-81. [c.151]

Получение гомогената скелетных мышц крысы. Среда выделения-. калий-фосфатный буфер — 0,05 М раствор, pH 7,6 pH буфера проверяют на потенциометре или с универсальным индикатором буферным методом. Всю посуду перед работой необходимо охладить на льду. [c.49]

Необходимо отметить, что скорость гидролиза гомогенатом кожи большинства веществ увеличивается примерно одинаково — в 2,3—5,4 раза. Исключение составляют лишь окисленные производные препарата М-77, ферментативный гидролиз которых ускорен, по сравнению со спонтанным более, чем в 10 раз. Это указывает, по-видимому, на то, что активность ферментов кожных тканей, ускоряющих гидролиз фосфорорганических веществ, не одинакова по отношению к различным представителям этого класса соединений. В настоящее время на основании полученных результатов можно высказать лишь предположение. Несомненно, оно нуждается в подтверждении дополнительными экспериментальными данными. [c.151]

Результаты проведенных нами исследований по гидролизу некоторых ФОС показали, что в присутствии гомогената кожи периоды полураспада их короче, по сравнению с соответствующими величинами при спонтанном гидролизе. Однако гидролитическое расщепление этих соединений и в присутствии гомогената кожи протекает очень медленно периоды полураспада исчисляются сотнями часов. Следовательно, из-за медленного течения такие процессы, по-видимому, не могут иметь практического значения. [c.181]

Экспериментальные приемы, применяемые в биохимии для изучения метаболизма, разнообразны. Исследования химических превращений проводятся на уровне целых органов, в тонких срезах и клеточных культурах, в гомогенатах тканей, органелл и очищенных ферментов. В любом эксперименте важную роль играют методы количественной регистрации химических превращений. Гравиметрические методы недостаточно чувствительны и часто непригодны для анализа органических соединений. Поэтому в биохимии широко применяются спектрофотометрические и колориметрические методы, имеющие высокую чувствительность и позволяющие определять очень небольшие количества веществ. Некоторые превращения сопровождаются поглощением или выделением газа. Для количественной регистрации таких превращений применяются манометрические методы. [c.5]

Прямой метод. В пробирки, содержащие 25—100 мг ткани, 1 мл гомогената или безбелкового раствора, добавляют по 3 мл 30%-ного раствора едкого калия. Пробы закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, содержимое пробирок количественно переносят в мерные колбочки на 25—50 мл в зависимости от содержания гликогена в пробах (1 мл получаемого раствора должен содержать от 3 до 30 мкг гликогена) и объем доводят водой до метки. В широкие пробирки берут по 2,5 мл полученного раствора, ставят их в лед, добавляют при встряхивании 5 мл раствора антрона, тщательно перемешивают, погружают на 10 мин в водяную баню при 90° С, затем охлаждают и фотометрируют при 620 нм. [c.24]

Непрямой метод. В центрифужную пробирку берут 25— 100 мг исследуемой ткани, 1 мл гомогената или безбелкового фильтрата, добавляют 3 мл 30%-ного раствора КОН и нагревают в кипящей водяной бане в течение 20 мин. Затем пробы охлаждают, добавляют равный объем (4 мл) спирта, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню. Когда спирт закипит, пробы охлаждают и осадок гликогена отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок гликогена растворяют в 1 мл дистиллированной воды [c.24]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

Работу проводят с экстрактами мышц, не содержащими митохондрий. При постановке опытов с гомогенатами, а также с экстрактами, содержащими митохондрии, тканевое дыхание выключают цианидом (конечная концентрация цианида—10 М) или проводят инкубацию в анаэробных условиях, в атмосфере азота или аргона. [c.49]

Мышцы спины и задних конечностей декапитированной крысы помещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 10 мин их вынимают по одной на чашку Петри, обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от жира и соединительной ткани и тщательно измельчают ножницами в кашицу. Навеску этой массы (3—5 г) берут на технохимических весах в фарфоровой чашке, предварительно взвешенной и стоящей во льду, и делят ее на 2—3 части для порционного гомогенизирования. Порцию кашицы переносят в охлажденный стеклянный стакан гомогенизатора Поттера с тефлоновым пестиком, добавляют 5 объемов среды выделения (на 1 г ткани 5 мл), перемешивают стеклянной палочкой и гомогенизируют 1—2 мин. Гомогенат сливают в стакан. Процедуру повторяют со следующими порциями гомогенаты объединяют. [c.49]

Получение экстракта, содержащего митохондрии. Гомогенат мышц центрифугируют в течение 10 мин при 600 и температуре 4°С для удаления обломков клеток и ядер. Надосадочную жидкость (экстракт мышц) фильтруют через четыре слоя влажной марли. Экстракт содержит гликолитические ферменты, митохондрии и микросомы. Измеряют pH и доводят его до значения 7,4. До опыта экстракт хранят при низкой температуре. Получение гомогената и экстракта рекомендуется проводить в холодной комнате и использовать в день получения, чтобы сохранить достаточно высокую активность митохондрий. [c.50]

Приготовление диализованного мышечного экстракта. Все процедуры по извлечению мышц осуществляют на холоде по возможности быстро. Реактивы и посуду предварительно охлаледают на льду. Используют скелетные мышцы крысы и кролика или грудную мышцу — у голубя. Взвешивают 3 г мышечной кашицы (приготовление см. на с. 49) и гомогенизируют с пятикратным объемом холодного 0,5%-ного раствора K I в течение 2 мин. Гомогенат центрифугируют в центрифу- [c.61]

Т. Fredriksson (1958) установил скорость гидролиза ряда ФОС — зарина и его аналогов — в присутствии гомогената кожи. В последующем было проведено сопоставление полученных величин со скоростью спонтанного гидролиза веществ. Это, вероятно, один из самых простых и вместе с тем убедительных способов доказать возможность превращений веществ в коже. Он позволяет установить, имеются ли в коже ферменты, способные гидролизовать те или иные вещества, и с известными допущениями судить о значении их для процесса всасывания и последующего эффекта вещества. [c.145]

Результаты исследований Т. Fredriksson показали, что скорость гидролиза изученных им соединений в присутствии гомогената кожи увеличивается, по сравнению со скоростью спонтанного гидролиза (табл. 16). Это означает, что зарин и его аналоги в коже подвергаются ферментативному гидролизу. [c.145]

При проведении исследований по гидролизу изучаемых веществ в присутствии гомогеиата кожи количественное соотношение между буферной системой и диоксаном сохранялось таким же. Теми же были концентрации действующих веществ. Отличия состояли лишь в том, что в пробирки с буфером, диоксаном и веществом добавляли гомогенат кожи крысы в количестве 300 мл. Пробирки тщательно встряхивали, затем перед помещением в термостат также проводили контрольное титрование (пробу предварительно фильтровали на воронке со стеклянным фильтром). [c.148]

Препарат Формула Спонтанный гидролиз Гидролиз 3 при-сутстнии гомогената кожи [c.150]

Способность кизельгура прочно сорбировать белки была использована В. С. Шапотом п сотрудниками, предложившими изящный метод фракционирования нуклеиновых кислот, входящих в состав клеточных нуклеонротеидов. Клетки гепатомы Зайделя, пометив предварительно в них РНК С- или Ш-уридином, а ДНК — Ш-ти-мпдпном, вскрывали детергентом, а гомогенат вносили на колонку, [c.245]

Пример 4. Очистка РПКазы D из Е. oli [ udny et al., 1981]. Здесь хроматографию на слабых анионообменниках использовали на двух первых этапах очистки. Интересно сопоставить их между собой. Освобожденный центрифугированием от рибосом гомогенат 300 г бактерии вносили на колонку DEAE-целлюлозы (8 X 25 см), уравновешенную 0,06 М раствором КС1 в 0,02 М Трис-НС1 (pH 7,5) с обычными для хроматографии белков защитными добавками (5 мМ [c.303]

На рис. 125 представлены результаты разделения белков из гомогената мышцы цыпленка на катионообменнике Mono S с помощью солевого градиента (1,75 мМ — 0,245 М Na I) в 0,05 М MES-буфере, pH G. Показано расположение ряда обычных мышечных ферментов. [c.316]

Получение экстракта, не содержащего митохондрий. Гомогенат мышц центрифугируют 10 мин при 12 000 —15 000 и температуре 4°С. Надосадочную жидкость, представляющую собой экстракт мышц, свободный от митохондрий, ядер и обломков клеток, фильтруют через четыре слоя влажной марли. Хранят до опыта в холодильнике. Работать необходимо со свежевыделенным экстрактом. Только в крайних случаях, когда работа не может быть выполнена в день получения, экстракт замораживают и в таком виде хранят. Предварительно измеряют pH, доводят его до значения 7,4. [c.50]

Мышечный гомогенат центрифугируют 10 мин в центрифуге с охлаждением при 12 000 g. Для инактивации глюкозофосфатизомера-зы проводят тепловую обработку. Мутный экстракт из центрифужных пробирок сливают в стеклянный стакан, доводят его pH до 5,0, добавляя по каплям 1 н. СНзСООН при постоянном перемешивании стеклянной палочкой. Проводят тепловую обработку стакан с экстрактом помещают в водяную баню, нагретую до 85—90°С, и нагревают экстракт, поддерживая указанную температуру в бане, до тех пор, пока его температура достигнет 65° (экстракт постоянно перемешивают). По окончании тепловой обработки стакан с экстрактом помещают в ледяную баню и охлаждают его до 4°С. Осадок денатурированных белков отделяют центрифугированием или фильтрованием. Центрифугат (фильтрат) хранят в рефрижераторе и используют его как источник фосфоглюкомутазы. Так как ферментативная активность сохраняется в течение нескольких недель, экстракт можно использовать при проведении повторных экспериментов. [c.60]

Получение безъядерного гомогената печени. Печень крысы (2 г) отмывают от крови в ледяном 0,9%-ном растворе Na l, обсушивают фильтровальной бумагой и измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Навеску ткани переносят в стакан стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком, добавляют 3 объема 0,25 М раствора охлажденной сахарозы и гомогенизируют в течение 1 мин. Гомогенат сливают в стакан, добавляют еще 7 объемов 0,25 М раствора сахарозы, перемешивают и центрифугируют при 600 g в течение 10 мин. Супернатант фильтруют через 4 слоя влажной марли и до опыта хранят на холоду. Полученная фракция представляет собой 10%-ный безъядерный гомогенат. Желательно использовать гомогенат в день получения, так как фермент при хранении быстро теряет актив-. ность. [c.65]

В пробы 1 и 2 (пробы до инкубации ) приливают по 3 мл 5°/о-ного раствора трихлоруксусной кислоты или 0,5 н. НСЮ4 до добавления гомогената. Пробы 3—6 инкубируют при 37°С в водяном термостате. По окончании инкубации в них добавляют по 3 мл 5%-ного раствора СС1зС00Н или 0,5 н. НСЮ4. Все пробы фильтруют или центрифугируют и в безбелковом фильтрате определяют неорганический фосфат и глюкозо-6-фосфат по нарастанию неорганического фосфата после щелочного гидролиза. [c.66]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология