Колонки уравновешивание

В литературе часто можно встретиться с утверждением, что уравновешивание силикагеля подвижной фазой требует пропускания через колонку значительных ее объемов, прежде чем будет достигнута стабильность времен удерживания. Из-за этого сущ,ественного недостатка рекомендуется предпочтительное использование обращенно-фазовых систем. По нашему мнению, утверждение о медленной стабилизации режима на силикагеле сильно преувеличено. Если только подвижная фаза содержит достаточное количество полярных компонентов для образования адсорбированной фазы, силикагель уравновешивается так же быстро, как химически модифицированные сорбенты. Бинарные элюенты, содержащие свыше 1,% полярного растворителя, почти всегда удовлетворяют этому условию. [c.132]

В качестве критерия установления стационарного режима в колонке может использоваться стабильность времен удерживания. На рис. 4.23 представлены кривые, свидетельствующие о том, что при использовании бинарных смесей гексана с пропа-нолом-2 уравновешивание колонки подвижной., фазой измененного состава требует пропускания всего 40 мл при объеме колонки 4,2 мл. Опасения относительно продолжительности стабилизации режима обоснованы лишь в случае, если концентрация пропанола-2 становится меньше 0,25%. [c.132]

В течение 30 мин поддерживают постоянный ток в колонке с указанной подвижной фазой для ее уравновешивания. Необходимо добиться стабильной базовой линии. Вводят раствор А и устанавливают базовую линию. Там, где указано, проводят тест для оценки адекватности системы. Перед проведением определения убеждаются в том, что разрешение и пик симметрии соответствуют требуемым критериям, указанным в статье. В стабильной системе время задержки и площади пиков при [c.422]

КИ, даже если вначале использовать свежую колонку. Если возможно, лучше всего использовать неподвижную фазу, которая уже содержит небольшие количества воды (например, 3— 5 масс. % силикагеля) [64]. Для приготовления подвижных фаз и растворов образцов используйте органические растворители, содержащие небольшие количества воды. Количества воды, присутствующего в обычных растворителях квалификации для жидкостной хроматографии , обычно достаточно [66]. Это способствует уравновешиванию колонки и хорошей воспроизводимости разделения. Если требуется сверхактивная неподвижная фаза для разделения очень неполярных соединений, то следует использовать чрезвычайно сухие материалы, получаемые путем обработки подходящими веществами, чувствительными к влаге. Неподвижную и подвижную фазы, возможно, лосле использования, следует удалить, если невозможно поддерживать влажность на необходимом уровне или если средства реактивации разделительной системы дороги или требуют большого времени. В некоторых ситуациях может быть желательно найти альтернативный способ разделения, который устраняет необходимость использования неподвижных фаз высокой активности. [c.78]

З. Уравновешивание колонки. Так как первоначальное введение элюента в хроматографический слой обычно приводит к некоторому изменению физико-химического состояния как неподвижной, так и подвижной фаз, то прежде, чем приступить к разделению, следует предусмотреть меры для того, чтобы две- [c.97]

Достижение равновесия может занимать от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от многих факторов,, включая состав подвижной фазы, скорость потока, природу неподвижной фазы, размер слоя в колонке и метод разделения. На основе опыта [66] получены следующие общие рекомендации, пригодные для различных ситуаций, встречающихся в уравновешивании разделительной системы [c.98]

Если сравнительная ячейка детектора должна содержать подвижную фазу, ее следует промыть перед началом проведения разделения элюентом после уравновешивания колонки. [c.99]

УФ-детектирование в случае использования элюентов с хорошим пропусканием не позволяет установить действительное уравновешивание колонки. Рефрактометрические детекторы намного более чувствительны к небольшому дрейфу в составе растворителя и поэтому могут дать лучшую информацию о состоянии разделительной системы в процессе уравновешивания колонки. Сигнал рефрактометрического детектора может быть обусловлен не только элюированием образцов, но и также изменением состава в распределительной системе жидкость — жидкость (ср. разд. 1.4.4.2), происходящим в результате элюирования образца. В таких случаях рекомендуется собирать весь элюат во фракции нужного размера. Соответствующие фракции могут быть объединены после дальнейшего анализа методом офф-лайн (вне потока) ьа присутствие компонентов образца. Фракции, содержащие только растворитель, могут быть отброшены или подвергнуты соответствующей регенерации. [c.100]

Инертный резервуар для подвижной фазы объемом 20— 40 колоночных объемов, дающий возможность подать количество подвижной фазы, необходимое для уравновешивания колонки, разделения и сбора по крайней мере интересующих компонентов к = 5—10). Резервуар должен давать возможность организации непрерывного перемешивания. [c.113]

Величины, измеренные в случае капиллярного насыщения (см. табл. 40), представляют собой концентрации, определенные в поперечном сечении. Они не дают информации о распределении между фазами. Такая оценка может быть произведена с помощью некоторых упрощающих предположений когда фронт растворителя поднялся на довольно высокий уровень (например, 5 или 10 см), можно считать, что даже в случае многокомпонентных растворителей подвижная фаза непосредственно над линией погружения совпадает по составу с залитой в камеру жидкостью (поскольку слой всегда пополняется свежей смесью). Кроме того, такой же состав имеет жидкость, испаряемая в конце концов с пластинки при непрерывном элюировании или выходящая из колонки (если обсуждается разделение в хроматографической колонке), когда достигнуто уравновешивание фаз через разделяющий слой. [c.140]

Подготовка ДЭАЭ-целлюлозы для хроматографии в С1 "-форме производится так же, как указано выше, но уравновешивание колонки, растворение фракционируемого материала и элюирование осуществляют буферными растворами, содержащими 8М мочевину. В качестве стартового буферного раствора в данном случае используют буферный раствор трис-НС pH 8, содержащий 0,05 М С1 и 8 М мочевины. Чтобы предотвратить агрегацию и ассоциацию молекул фракционируемого материала в присутствии мочевины, к буферному раствору добавляют 0,1% додецилсульфата натрия. В полученном растворе, содержащем оба детергента (мочевину и додецил-сульфат натрия), растворяют фракционируемый материал, который диализуют против того же раствора в течение 24 ч. [c.207]

X 60 см, оставляют для оседания. Затем целлюлозу уплотняют сжатым воздухом под давлением 0,5 атм. После этого проверяют полноту уравновешивания, т. е. определяют, равен ли pH элюата pH стартового буферного раствора. Если равенства нет, через колонку ионообменника пропускают дополнительно стартовый буферный раствор до тех пор, пока колонка не уравновесится. [c.209]

Способы набивки колонки, ее уравновешивания прокачкой исходного элюента, внесения препарата, а также варианты и методы осуществления элюции подробно описаны в хл. . Однако следует отметить некоторые особенности, присущие использованию ионообменников. Главная из них связана с возможностью изменения объема обменника (высоты его столба в колонке) при изменении pH и концентрации соли в ходе элюции, особенно для ионообменных сефадексов типов А-50 и С-50. В связи с этим использование адаптора может оказаться неуместным, так что препарат приходится вносить в открытую колонку. Поверхность ионообменника в таком случае иногда защищают от взмучивания слоем сефадекса G-25 толщиной около 5 мм или кружком фильтровальной бумаги (следует убедиться, что препарат пе сорбируется на нем). В ответственных случаях фракционирования препарат имеет смыс. г подслаивать под буфер, как было описано в гл. 3. Следует помнить, что ионообменные сефадексы типов А-50 и С-50 гораздо мягче, чем сам сефадекс G-50. Их следует набивать в колонку с теми же предосторожностями, что были описаны в гл. 4 для сефадекса G-100. [c.281]

Для полного извлечения нуяшого бе.ика экстракт, прошедший через колонку в исходном буфере, после окончания элюции и нового уравновешивания колонки буфером пропускали через нее повторно и элюировали по той же схеме так повторяли 8 раз. В итоге нуж-1[ЫЙ белок ( DB-1 ) из 1 кг яиц дрозофилы получали очищенным в 200 ООО раз. [c.425]

Колонку (размером 1,5x50 см) подготавливают так, как описано на с. 103. В нее вносят относительно густую суспензию полностью набухшего геля. Для предотвращения образования пузырьков воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением колонки можно деаэрировать с помощью водоструйного насоса в колбе Бунзена или вносить его в колонку при температуре, значительно превышающей комнатную (50—60 °С). Сефадексу в колонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения постоянной высоты столба геля колонку промывают 3—5 объемами буферного раствора. Гидростатическое давление для сефадекса G-100 не должно превышать 50 см /1=20—50 см (давление при разделении образца и при заполнении колонки должно быть одинаковым). Для проверки равномерности заполнения через колонку можно пропустить раствор окрашенного белка, например цитохрома с или голубого декстрана. При этом окрашенная зона должна быть компактной и двигаться по колонке параллельно ее основанию. [c.107]

После описанной обработки ионит уравновешивают буферным раствором, в котором осуществляют сорбцию белков на ионообменнике (исходный буферный раствор). Эту процедуру можно проводить как на колонке, так и пне ее. Обработку исходным буферным раствором осуществляют до тех пор, пока не произойдет выравнивания pH элюата на выходе из колонки (или жидкости, в которой суспендируют ионит) с pH исходного буферного раствора. Уравновешивание — процесс медленный. Для его ускорения ионит можно сначала обработать раствором того же состава, что и исходный, но с большей концентрацией, а после достижения нужного значения pH уравновешивание продолжают исходным раствором. Другой способ уравновешивания заключается в том, что ионит суспендируют в исходном буферном растворе до получения достаточно жидкой суспзнзии. Добавлением раствора, содержащего соответственно кислый или основной компонент исходного буфера, доводят pH (на рН-метре) до нужного значения. Затем сорбент уравновешивают исходным буферным раствором. Во всех случаях конечное состояние равновесия (величину pH) необходимо контролировать. [c.110]

Гель-хроматография. Полученный раствор наносят на колонку с сефадексом G=100 (2,5x100 см). Уравновешивание колонки и элюцию осуществляют тем же буфером. Фракцию фермента разливают на порции и хранят при —70° С. [c.231]

Гель-фильтрация. Готовят колонку (20x40 см), заполненную сефадексом 0-75 и уравновешенную 0,1 М сульфатом аммония, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол, pH 6,0. На колонку наносят около 2 мл раствора белка и пропускают раствор, используемый для уравновешивания колонки. Анализируют фракции элюата, определяя в них содержание белка и активность фермента. Собирают и объединяют фракции, содержащие наибольшее количество активного белка. Гель-фильтрацию можно повторить на той же колонке с новыми порциями раствора белка. Объединенные элюаты концентрируют путем осаждения белка сульфатом аммония (конечная концентрация — [c.262]

Выбор сорбента и колонки для ГВЭЖХ также имеет свои особенности. Прежде всего, колонка должна быстро приходить в равновесие с растворителем постоянно изменяющегося состава как в процессе градиентного элюирования, так и при возвращении к исходному составу растворителя при подготовке колонки к новому анализу. Если для старых колонок в жидкостной хроматографии, работавших однократно, градиент формировался и использовался один раз, после чего сорбент в колонке заменялся свежим, и это позволяло применять силикагель и оксид алюминия, то для ГВЭЖХ эти сорбенты не подходят, так как уравновешивание их со слабым растворителем после градиента слишком длительно. Однако современные обращенно-фазные и другие привитые сорбенты достаточно быстро приходят в равновесие с исходным растворителем после окончания градиентного элюирования, что позволяет успешно использовать их для этих целей. Время, необходимое для уравновешивания колонки, для каждого сорбента устанавливается экспериментально по достижению постоянства времени удерживания веществ, входящих в анализируемую смесь. Это время различно как для разных сорбентов, так и для разных по составу растворителей, и может колебаться от десятков до нескольких сотен минут. [c.66]

К недостаткам полужестких гелей следует отнести ограничение по растворителям, значительное время уравновешивания колонок и возможное снижение их эффективности при замене подвижной фазы, а также относительно невысокое предельное рабочее давление. Кроме того, эффективность колонок с полужесткими гелями может резко понизиться при попадании в них пузырьков воздуха. Воздух блокирует поры геля и очень трудно удаляется. Поэтому при работе с полужесткими гелями требуется особенно тщательная дегазация растворителя и внимательная сборка хроматографической системы. [c.106]

Начинать следует с подготовки хроматографической системы. Ее следует тщательно проверить, приготовить нужный растворитель, промыть, уравновесить колонку с новым растворителем. Если возможно, после этого ввести тестовую смесь, чтобы убедиться в том, что колонка и вся система в целом наводятся в рабочем состоянии. Уравновешивание колонки с растворителем следует проводить до тех пор, пока параметры удерживания тест-веществ не станут совершенно стабильными. Затем следует перейти к анализу. На начальном этапе работы не следует увлекаться высокой чувствительностью детектирования, за исключением только тех случаев, когда исследователь не располагает чистыми стандартами и вынужден сразу работать с образцами, чистота которых вызывает сомнение. Однако и в этих случаях лучше провести очистку до ВЭЖХ, использовав метод ТСХ или другой. [c.136]

Бетге и др. [87] разработан количественный метод газовой хроматографии смеси, содержащей арабинозу, ксилозу, фукозу, маннозу, глюкозу и галактозу. Сущность этого метода заключается в следующем. Образец смеси, содержащий 10 мг углеводов, освобождают от воды и растворяют в пиридине. Уравновешивание различных форм углеводов ускоряется прибавлением перхлората лития в качестве катализатора. В раствор для получения триметил-силиловых эфиров моносахаридов прибавляют триметилхлорсилан и гексаметилдисилазан, затем пиридин удаляют выпариванием, а образовавшиеся эфиры растворяют в м-гексане. Раствор хроматографируют на колонках с бутандиолянтарным полиэфиром, нитросиликоновыми смолами и полифенилэфирами, нанесенными на твердый носитель. Полученные хроматограммы анализируют при помощи интегратора. Величины полученных пиков пропорциональны количествам присутствующих в смеси моносахаридов. Площади пиков используют для вычисления относительного содержания сахаров в смеси. [c.82]

Препаративная ЖХ. Колонка силикагелевый картридж преппак-500, нутр=5,7 см, /=30 см. Объемная скорость 350 мл/мин. Детектор РФ. Размер образца 10 г в 100 мл подвижной фазы. Время анализа приготовление колонки—1,5 мин, смачивание и уравновешивание колонки — 5,0 мин, приготовление и введение образца — 2 мин, разделение и сбор фракций — 8 мин, общее время разделения— 16,5 мин. [c.67]

Предпочтительным растворителем для препаративной ЖХ является этилацетат, поскольку он обеспечивает хорошую растворимость для многих образцов, поддерживает длительную эксплуатацию колонки, способствует быстрому уравновешиванию ее и легко отгоняется от собранных фракций. Количество этилацетата в подвижной фазе для ТСХ подбирается таким образом, чтобы получить полярность, которая позволяет элюировать растворенные вещества в пределах 0,15—0,35 Наблюдается хорошая корреляция между ТСХ и препаративной ЖХ, если подвижная фаза содержит растворители равной или меньшей полярности, чем этилацетат. [c.150]

В случае более полярных растворителей сродство между силикагелем и растворителем становится большим и корреляция между ТСХ и препаративной ЖХ менее надежна. Для того чтобы была корреляция, смесь растворителей для уравновешивания препаративной колонки долл<на содержать только 10— 20% от количества полярного компонента, используемого первоначально в ТСХ-разделепиях. Для обеспечения воспроизводимости корреляции в системах растворителей, содержащих спирт, требуется тщательное предварительное кондиционирование разделительной колонки и растворителя. [c.150]

Смолу смешивают с 0,2 н. NaOH, надосадочную жидкость декантируют, а осадок заливают раствором Г или Д при работе в двухбуферной и раствором Е при работе в трехбуферной системе. После 30 мин уравновешивания жидкость декантируют, а смолу вновь суспендируют в данном растворе. После очередной декантации смолу смешивают с двумя объемами раствора и вливают в колонку, как описано выше. Важно заполнять колонку в растворе высокой молярности. После того как столбик смолы в колонке достигает 50 см, для окончательной упаковки через колонку в течение 20 мин пропускают раствор высокой молярности. Затем повторяют пропускание растворов, начиная со стартового, и этот цикл обработки проделывают еще 3 раза. Следует иметь в виду, что из-за различий Б молярности продолжительность каждого цикла занимает по крайней мере 20 мин. [c.177]

А. Подготовка колонки. Соответствующее количество фосфо-целлюлозы (Ф-целлюлозы) сначала с помощью декантации трижды отмывают дистиллированной водой, а затем последовательно 0,5 М NaOH, дистиллированной водой, 0,1 М Н3РО4, дистиллированной водой и стартовым буферным раствором. Отмывание дистиллированной водой всегда продолжают до тех пор, пока pH надосадочной жидкости не достигнет pH воды. Окончательное уравновешивание лонообменника стартовым буферным раствором производят уже в колонке. [c.214]

Ароматические и основные аминокислоты на пластинке Фик-сиоц 50 X 8 разделяются при одномерной хроматографии в цитратном буферном растворе pH 5,23 с концентрацией Ыа" 0,35 М (буферный раствор В, табл. 10), который используется в двухколоночной системе аминокислотного анализатора. Типичная хроматография такого разделения представлена на фиг. 49. Колебания pH и концентрации буферного раствора не существенны для фракционирования. Хроматографию проводят при комнатной температуре без предварительного уравновешивания. В камеру наливают слой буферного раствора высотой примерно 1 см. При хроматографии фронт буферного раствора должен подняться на высоту 15 см. Если пластинка не уравновешена, на это уходит около 2 ч. На уравновешенной пластинке (см. буферный раствор для уравновешивания, табл. 10) это происходит за несколько ми-нут. На примере разделения ароматических и основных аминокислот можно оценить Лиз высокую разрешающую спо-Гис обность ионообменной хроматографии в тонком слое по сравнению с соответствующей колоночной техникой. Известно, что на малой колонке в этом же буферном растворе (т. е. 0,35 М Ыа+, pH 5,23) ароматические аминокислоты не отделяются друг от друга. [c.250]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология