Кривые реассоциации

Рис. 17. Идеализированная кривая реассоциации цепей денатурированной ДНК (см. также рис. 107 и пояснения к нему к тексте)

На рис. 107, б представлен лишь один из вариантов выявляемых кривых реассоциации ДНК эукариот, которые могут существенно различаться даже у близкородственных видов. Подобные результаты, полученные для геномов самых разных представителей эукариот, привели к заключению, что существенная часть генома (15—40 % или более, имеются значительные вариации для разных организмов) состоит из повторяющихся в разной степени последовательностей ДНК. Различают уникальные, умеренно повторяющиеся и высокоповторяющиеся последовательности ДНК эукариот, соответствующие трем выявляемым при ренатурации фракциям. Деление фракций на умеренно и высоко повторяющиеся достаточно условно. Гибридизационные методы дают достаточно грубую валовую характеристику генома в целом. Оценки числа копий генов, проведенные гибридизационными методами, не всегда давали правильные результаты вследствие ряда артефактов, сопровождающих эти эксперименты. [c.188]

К примеру, среднее значение величины / для промежуточного компонента кривой реассоциации, приведенной на рис. 17.3, составляет 630/1,9= 332. (Это значение несколько отличается от значения, вычисленного по уравнению 6 и соответствующего значению / для неповторяющейся ДНК, равному 1,05) [c.227]

Метод, применяемый для идентификации индивидуальных компонентов, основан на использовании программы для ЭВМ, с помощью которой пытаются подобрать индивидуальные кривые (для гипотетических, кинетически однородных фракций) для каждой области кривой реассоциации. Эти индивидуальные кривые перекрываются и в сумме образуют кривую, отражающую наблюдаемое поведение последовательностей генома. Как отмечалось ранее, если приготовить смесь препаратов ДНК с определенными значениями сложности, ее кривая реассоциации совпадет с экспериментальной кривой для геномной ДНК. [c.227]

Обычный подход при компьютерном анализе состоит в поиске минимального числа индивидуальных кинетических компонентов, суммирование кривых реассоциации которых обеспечит достаточно хорошее приближение к экспериментальной кривой. Однако это не обязательно отражает биологическую структуру генома. Часто оказывается возможным получить столь же хорошее приближение и при большем числе компонентов. Например, данные, приведенные на рис. 17.5, можно также объяснить наличием трех умеренно повторяющихся компонентов, составляющих 10, 27 и 25% ДНК генома с частотами повторяемости 8000, 240 и 19. При таком анализе также получают меньшие значения размеров компонента неповторяющейся ДНК. [c.227]

Так же как и в случае кривой реассоциации ДНК, каждый компонент гибридизуется в пределах значений [c.233]

При исследовании реассоциации ДНК эукариотической клетки выявляются аномалии кинетики реакции (рис. 107, б). Например, на кривой реассоциации ДНК из тимуса теленка можно различить ступеньки, которые отражают отдельные этапы реакции. Первая ступенька указывает на наличие быстро ренатурирующей фракции 1 (25 % ДНК). Следующ,ая соответствует фракции 2, ренатурирую-Щей со средней скоростью (30 % ДНК) и, наконец, остальная часть ДНК (45 %), представ-1енная фракцией 3, ренатурирует медленно. Количество ДНК во фракции может быть определено исходя из значения ot /i. Так, например, значение ot .U для фракции 2 (1,9) Почти в 5 раз ниже ее значения для ДНК Е. соИ. В таком случае сложность фракции 2 составляет всего 10 п. и. В то же время коли- [c.187]

Вместо того чтобы проводить описанную выше серию вычислений, частоту повторяемости любого компонента кривой реассоциации можно определить непосредственно путем сравнения с компонентом неповторяющейся ДНК. Зависимость между частотами повторяемости любых двух компонентов одной и той же кривой реассоциации обратно пропорциональна отношению их значений oti/2- Поэтому, если допустить, что неповторяющаяся ДНК действительно уникальна (ее величина / равна 1,0), можно написать другое уравнение для определения частоты любого повторяющегося компонента [c.227]

РНК- (или ДНК-) зонд участвует в реакции так, как если бы он просто входил в состав фракции последовательностей, с которой он транскрибировался. Эту фракцию выявляют, сравнивая кривую гибридизации радиоактивного зонда с кривой реассоциации всей ДНК. Поэтому значения при которых гибридизуется меченая РНК, могут быть использованы для определения частот повторяемости соответствующих последовательностей генома. Когда зондом служит индивидуальная мРНК, она гибридизуется при единственном значении СоЬ/г, зависящем от частоты повторяемости гена или генов, представляющих ее в геноме. Для уникального гена эта величина будет такой же, как для неповторяющейся ДНК, в то время как для повторяющихся генов будет наблюдаться соответствующее уменьшение значения При использовании популяции молекул мРНК каждая мРНК гибридизуется при определенном значении Со х/г так, что кривая в целом представляет собой сумму кривых гибридизации индивидуальных компонентов. Такую кривую можно разложить на составляющие ее компоненты так же, как и кривую реассоциации самой ДНК генома. [c.231]

Рис. 18.1. Сопоставление кривой гибридизации мРНК-зонда с кривой реассоциации указывает на то, что основная часть последовательностей мРНК считывается с неповторяющейся ДНК, а остальные последовательности - с умеренно повторяющейся ДНК. На высокоповторяющейся ДНК мРНК не синтезируются.

Проведем теперь тот же самый эксперимент с ДНК коровы. Ее геном (3-10 пар нуклеотидов) превратится в 7 500 000 двухцепочечных фрагментов ДНК, а после нагревания — в 15 ООО ООО одноцепочечных. Если каждый фрагмент представлен единственной копией, то кривая реассоциации должна быть похожа на кривую, которая получается в опыте с фрагментами ДНК Е. oli. Но это не так (рис. 15-1, справа). Значит, некоторые фрагменты присутствуют во мпогих копиях. Их комплементарные цепи встречаются очень часто, и ренатурация идет очень быстро. Другие фрагменты представлены меньшим числом копий, их реассоциация идет медленнее, чем в первой группе, но все еще достаточно быстро. Эти повторяющиеся фрагменты составляют приблизительно 40% всей ДНК коровы Оставшиеся 60% фрагментов, вероятно, уникальны, и их реассоциация идет со скоростью, сравнимой со скоростью реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ. [c.264]

Анализ кинетики ассоциации. На кривых реассоциации геномной ДНК повторяющимся последовательностям соответствуют участки с низким и средним значениями ot, а уникальным участок с высоким ot (гл. 7.5.6). Если для определения доли реассоциированной ДНК используется гидро-ксилапатит, то двухцепочечными считаются как частично, так и полностью ренатурировавшие молекулы (рис. 9.34). В результате мы получаем кажущееся увеличение доли геномной ДНК, реассоциирующей при низких и средних значениях ot, при увеличении длины фрагментов ДНК. Это происходит потому, что повторяющиеся последовательности, которые реассоциируют при относительно низких ot, рассеяны по геному среди последовательностей с низким числом копий (рис. 9.35). В опытах, о которых идет речь, определяется зависимость доли ДНК, считающейся двухцепочечной по данным связывания с гидроксилапатитом, от длины фрагментов ДНК. Чтобы получить препараты молекул ДНК разной длины, суммарную ДНК фрагментируют случайным образом и затем разделяют по размерам центрифугированием в градиенте плотности. Фрагменты денатурируют и отжигают при фиксированных значениях ot, слишком низких для реассоциации уникальных одно-копийных последовательностей. [c.198]

Разные типы распределения повторов. Некоторые тиш1чные кривые реассоциации показаны на рис. 9.36. Во всех трех случаях доля ДНК, связывающейся с гидроксилапатитом, возрастает с увеличением длины цепи, однако кривые существенно [c.198]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология