Копийность ДНК

Многие репликоны используют, по-видимому, совершенно иную стратегию регуляции собственного синтеза. Для инициации репликации этих репликонов необходим белок-инициатор (например, белок Е в случае плазмиды F). от белок специфически связывается с определенной последовательностью ДНК, многократно повторенной на данном репликоне. Связывание белка-инициатора с одной или несколькими такими последовательностями, находящимися в ориджине, необходимо для инициации. Одна из последовательностей находится в начале гена бел ка-инициатор а, так что связывание с ней белка подавляет его собственный синтез. Считается, что регуляция репликации осуществляется благодаря сложной конкуренции за белок-инициатор между участком ДНК, необходимым для собственной репрессии, участком (или участками), необходимым для инициации синтеза ДНК, и другими участками связывания. Хотя подобные репликоны пока еще недостаточно изучены и детальная картина регуляции репликации не ясна, очевидно, что наличие множественных мест связывания ключевого белка инициации репликации позволяет регуляторной системе очень чутко отзываться на изменение копийности репликона. Например, если плазмида содержит 10 повторенных мест связывания белка-инициатора, то появление за счет репликации од ой дополнительной копии плазмиды увеличит число участков связывания на 10. В определенном смысле многократно повторенные участки связывания белка-инициатора, суммарное количество которых пропорционально копийности репликона, аналогичны ранее рассмотренной ингибиторной РНК, концентрация которой также пропорциональна копийности. [c.67]

К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие малый размер генома, что дает возможность легко манипулировать вирусной ДНК высокая копийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50 ООО на клетку) наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов. [c.57]

ВАС-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в бактериальных клетках, и ряд дополнительных последовательностей для облегчения клонирования. Емкость ВАС-векторов при собственном небольшом размере ( 7 т. н. п.) огромная — 100—300 т. н. п. Это позволяет во много раз уменьшить число клонов при получении геномных библиотек (см. ниже). [c.41]

Многие мелкие репликоны используют альтернативную стратегию стабильного наследования. Они, по-видимому, не имеют механизма упорядоченной сегрегации, но поддерживаются в высоком числе копий. Высокая копийность обеспечивает относительно стабильное наследование репликона при случайном распределении молекул по дочерним клеткам при делении. Вероятность того, что репликон при таком способе распределения будет утерян (т. е. в одну из дочерних клеток не попадет ни одной копии ДНК данного репликона), равна (1/2) , где п — число копий, т. е. меньше 0,1 % уже для 10 копий плазмиды в клетке. Естественно, для этого способа принципиально важным является строгое восстановление копийности, чтобы единственная молекула ДНК успела быстро размножиться до характерного для нее числа копий до начала следую-ш,его деления клетки. [c.69]

Использование бактериальных плазмид в качестве векторов для клонирования. Клетки бактерий содержат хромосомную ДНК. Однако помимо хромосом бактерии содержат большое число небольших (1—25 т. н. п.) кольцевых молекул ДНК. Такие кольцевые молекулы называют плазмидами. Некоторые плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, представленные большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, биохимически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость бактериальной клетки к последним. [c.37]

При построении физических карт тех или иных районов хромосом или целых хромосом из геномных библиотек, содержащих крупные вставки (YA -, ВАС- или РАС-библиотек), наиболее приемлем метод картирования, основанный на использовании STS. STS — это короткий одно-копийный участок ДНК (примерно 100-300 п. п.), который можно вьшвить при помощи ПЦР с использованием уникального набора праймеров. Для получения протяженного контига, охватывающего значительный участок хромосомы, требуется большое число STS, находящихся на расстоянии 50-100 т. п. н. друг от друга. Напри- [c.462]

На первый взгляд может показаться, что высокая копий-ность плазмиды благоприятствует максимальному уровню экспрессии. Однако это не всегда так. Дело в том, что некоторые белки токсичны для дрожжевой клетки. В результате происходит селекция клеток с пониженным уровнем экспрессии таких белков, а это обычно бывает обусловлено снижением копийности плазмиды вплоть до полной ее утраты. В подобных случаях интеграция плазмиды в какую-нибудь дрожжевую хромосому [c.211]

При низкой копийности обеспечивает стабильность системы и достаточно высокий уровень экспрессии [14]. [c.213]

Анализу предполагаемых трансформантов обычно придается большое значение, и мы не остались в стороне от этой проблемы и разработали несколько соответствующих методик. Не нужно объяснить, насколько важно определить, являются ли колонии, отобранные как трансформанты, на самом деле трансформантами или же это ревертанты. Анализ трансформантов предполагает гибридизацию с колониями или выделение и анализ плазмидной ДНК. Кроме того, для оценки экспрессии чужеродного гена в дрожжевой системе весьма важно определить копийность плазмиды как фактор, оказывающий существенное влияние на уровень экспрессии. [c.230]

Фрагменты, присутствующие в ДНК трансформированного растения, которые полностью гомологичны фрагментам ДНК плазмидного вектора, получаемым при обработке тон же нуклеазой. Внутренние фрагменты в геле мигрируют аналогично соответствующим фрагментам исходной ДНК плазмидного вектора и при одинаковой копийности дают на радиоавтографе-зоны с такой же интенсивностью. [c.314]

Анализ числа пограничных и составных фрагментов можно использовать для определения содержания отдельных вставок Т-ДНК (число вставок) в трансформированной ткани. Копийность (т. е. общая копийность всех типов вставок Т-ДНК в трансформированной ткани) определяют, сравнивая интенсивность внутренних фрагментов с полосами исходной Т-ДНК на радиоавтографах. [c.315]

Отмечают на радиоавтографе каждую полосу, которая имеет отличную от исходной Т-ДНК подвижность. Если таких полос несколько и копийность внутренних фрагментов более 1 на геном, то в этом случае полосы, обладающие иной, чем [c.315]

Для правильной интерпретации данных, полученных в результате блоттинг-гибридизации по Саузерну, и для получения максимального количества информации на фильтр следует нанести различные образцы исходной ДНК. Такая исходная ДНК важна для определения копийности гена или изучаемой [c.319]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большого числа копий молекул нуклеиновых кислот — 10 и более молекул на зараженную клетку. Например, при репликации вируса табачной мозаики образуется 10 молекул нуклеиновых кислот (РНК) на клетку. Поэтому фргговирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преимуществ малый размер генома (возможность легкой манипуляции вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечивающие эффективную экспрессию чужеродных генов. [c.148]

Контроль копийности с помощью РНК-ингибитора, влияющей на вторичную структуру другой РНК, необходимой для инициации, характерен не только для плазмид типа olEl. Другие варианты той же стратегии используют, например, плазмида Е. соИ R1 и стафилококковая плазмида рТ181. [c.67]

ДНК эукариотического генома можно разделить на два класса последовательностей . Это уникальные, или неповторяющиеся, последовательности и повторяющиеся последовательности ДНК (повторы). К первому классу последовательностей ДНК относятся однокопийные гены, кодирующие белки. Класс повторяющихся последовательностей ДНК представлен повторами с копийностью от 2 до 10 на клетку. [c.69]

Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было-обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов контролирующих начало репликации. Если уж репликация началась, то она идет с относительно постоянной скоростью при любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в случае много-копийных плазмид, чем малокопийных. [c.305]

Среднее число молекул каждого вида мРНК, приходящееся на клетку, называется ее копийностью (abundan e) или представленностью. Эту величину очень просто определить, если известно общее количество РНК в клетке. Для каждого кинетического компонента (фракции) общее количество РНК = Представленность - Сложность, поэтому в общем виде уравнение выглядит следующим образом [c.234]

В обоих случаях для улучшения штаммов классическая селекция применяла мутагенез с последующим отбором. В тех случаях, когда это было возможно, применялись методы скрещивания или другие способы передачи генетической информации. В последние годы эффективным методом передачи генетической информации признано слияние протопластов. Тем не менее применение этих методов ограничено, так как мутации способны лишь изменить (скорее нарушить) систему регуляции микроорганизма. Генетический обмен помогает собрать в одной клетке полезные мутации и избавиться от вредных. Все до сих пор суп1,ест-вовавшие методы генетического обмена ограничены пределами одного вида (или близкородственными видами), так как основаны на классической рекомбинации. На молекулярном уровне это означает высокую гомологию в последовательностях ДНК- С помощью методов генной инженерии создалась возможность для введения новой генетической информации в клетку или увеличения копийности уже существующих генов. [c.106]

Причины такого повышения активности не всегда ясны. Возможно, в новом хозяине повышается стабильность белка или мРНК или сигналы иниациации транскрипции и (или) трансляции используются более эффективно. Не исключено также, что весь эффект связан с увеличением копийности плазмид в новом хозяине. [c.198]

Как, должно быть, уже заметил читатель, оптимальный подход к изучению сцепления зависит в некоторой степени от точного знания природы генетических трудностей, которые предстоит преодолеть (к примеру, количество различных локусов, ответственных за гетерогенное нарушение уровень фено-копийности). Однако не часто такие подробности можно с точностью заранее определить. Следует начинать изучение сцепления с выявления на основе имеющихся данных спектра возможных осложнений. Далее следует определить доступный популяционный материал (включая большие родословные, изолированные популяции, детей от близкородственных браков) и арсенал медицинских методов (включая клинические методы дифференциации фенотипов), который можно использовать для упрощения задачи. Затем, основываясь на допущениях, принятых для различных типов наследования, следует вычислить количество различных семей, необходимое для картирования признака. В конечном счете проводится подбор семей, готовятся препараты ДНК. которые анализируют по большому количеству ПДРФ. Если предположения о генетической этиологии заболевания верны, то вероятность обнаружения сцепления велика. Если же признак в действительности более сложен, чем это предполагалось, сцепление не будет обнаружено. Отрицательный ответ при поиске по всему геному докажет по крайней мере, что заболевание более сложно, чем исходно предполагалось. [c.237]

В некоторых случаях для тестирования последовательностей чужеродного гена в трансформированной ткани можно использовать метод дот-блоттинг-гибридизации ДНК. Изучение организации чужеродной ДНК, встроенной в геном растения, лучше всего начинать с блоттинг-гибридизации по Саузерну (гл.5 и разд. 6.2). Данный метод позволяет определить копийность встроенных последовательностей ДНК, выяснить, расположены ли эти многочисленные вставки тандемно либо рассеяны по геному, а также оценить стабильность этой ДНК в поколении Fl трансформированных растений. Весьма важно получить как можно больше данных о строении и расположении перенесенных генов в геноме трансформированного растения, поскольку от этого в значительной степени может зависеть их экспрессия и наследуемость. Для подробного анализа организации чужеродной и окружающей ее ДНК требуются такие методы выде- [c.236]

Первое, с чего следует начать при постановке блоттинг-гибридизации по Саузерну,—это решить, с помощью какой рестриктазы (рестриктаз) можно получить требуемую информацию, используя имеющиеся в распоряжении пробы для гибридизации. Например, для точного определения копийности необходимо, чтобы вся ДНК встроенного гена умещалась в одном рестрикционном фрагменте и ее радиоактивный сигнал мог быть сравним с искусственной исходной ДНК. Изучение рестрикционной карты pGV3850 1103 (рис. 6.4) показывает, что в случае гена npt-II этого можно достигнуть с помощью двойного расщепления Hindlll и B oRl, либо используя каждый из ферментов по отдельности. Для всех трех случаев необходимо отметить следующее. Во-первых, прн этом образуется фрагмент, включающий в себя все последовательности, гомологичные ДНК-пробе причем проба гибридизуется только с одной полосой на фильтре, и, во-вторых, эти фрагменты не содержат пограничных последовательностей Т-ДНК, что вызвало бы появление большого числа гибридизующихся полос, если множественные вставки происходят более чем по одному сайту ДНК растения. [c.319]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология