Рестриктазы, обработка

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (—) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А, 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X - расстояние между сайтами А и 1, У - расстояние между сайтами 1 и В, X + У -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт 1 интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и У. Если же он изменен (—), то образуется единственный фрагмент (X + V). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + V), если он изменен (-). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, -/-). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом Р или у.

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов - при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов (дополнение 4.1). На рис. 4.4,А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью. Из этих данных следует, что данный участок ДНК имеет по два сайта для ВатШ и ЕсоШ. [c.53]

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами (участками) без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач. [c.108]

При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше. [c.219]

Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очишают (рис. 25.1). [c.222]

Каждый гель на рис. 3.2 обозначен в соответствии с использованным ферментом и размером фрагментов, которые были экстрагированы из гелей, изображенных на рис. 3.1. Так, А-2100 означает фрагмент в 2100 п.п., полученный в результате обработки исходной молекулы ДНК ферментом А. После того как этот фрагмент извлекли из геля и обработали рестриктазой В, образовались два фрагмента размером 1900 п. н. и 200 п. н. Другими словами, разрез, сделанный ферментом В, находится на расстоянии 200 п. н. от ближайшего разреза ферментом А с одной стороны и на расстоянии 1900 п. п.-от ближайшего разреза ферментом А-с другой. Относительное положение разрезов видно при анализе чувствительности фрагмента В-2500 к ферменту А. Фрагмент В-2500 разрезается на два фрагмента размером 1900 п.п. и 600 п.п. Таким образом, фрагмент 1900 п.п. образуется в результате двух разрезов-в А-сайте с одного конца и В-сайте с другого. Поскольку этот фрагмент образуется в результате расщепления двух разных фрагментов (А-2100 и В-2500), можно думать, что эти фрагменты перекрываются и область размером 1900 п.п. является для них общей. [c.44]

Четыре фрагмента, полученные в результате действия рестриктазы А (см. рис. 3.1), элюировали из геля и обработали рестриктазой В (четыре геля слева). Также три полоски, полученные после обработки рестриктазой В, выделили и обработали рестриктазой А (три геля в центре). В контрольной пробе интактную ДНК обрабатывали двумя рестриктазами одновременно (гель справа). [c.45]

На правом конце карты фрагмент в 800 п. н. получен после обработки фрагмента В-1300 рестриктазой А. Следовательно, правее его располагается фрагмент в 5000 п. н. Поскольку рестриктаза В не расщепляет фрагмента А-500, он служит правым концом и завершает построение карты. [c.45]

Распределение сайтов узнавания фермента носит случайный характер по отношению к геному в целом. Поэтому обработка эукариотической ДНК рестриктазами приводит к образованию множества фрагментов. При электрофорезе в геле эти фрагменты образуют пятно, в котором неразличимы отдельные полосы (за исключением ряда полос, соответствующих некоторым повторяющимся последовательностям, рассмотренным в гл. 24). [c.243]

Некоторые рестриктазы по отношению к сателлитной ДНК ведут себя иначе. При обработке этими ферментами образуются последовательности одного и того же размера. Но они расщепляют только небольшую часть ДНК, скажем 5-10%. Из этого следует, что повторяющиеся единицы, имеющие такой специфический сайт рестрикции, сосредоточены в определенном участке сателлитной ДНК. По-видимому, все группы повторов в этом домене произошли от родоначальной последовательности (утратили его в результате мутации). [c.306]

Такая рекомбинация объясняет картину, получаемую при обработке сателлитной ДНК мыши рестриктазами. На рис. 24.9 показано, что помимо групп целых повторяющихся единиц в меньшем количестве представлены [c.307]

Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еще в 50-х гг. Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еще в 60-х г. был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвенирования ДНК [117]. Принцип состоит в следующем длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно [c.131]

Выбранный фрагмент ДНК (в данном случае из генома дрозофилы) встраивали в плазмиду, которую отбирали, размножали и очищали методами генной инженерии (1). Затем ее линеаризировали обработкой рестриктазой, не затрагивающей встроенный фрагмент (2). После этого с помощью ограниченного гидролиза экзо-нуклеазой III (30 мин при 0°) удаляли с З -концов каждой из нитей около 300 оснований (3). Обработанную таким образом ДНК сажали на активированную по методу Нойеса и Старка (см. выше) л-амино-бензилоксиметилцеллюлозу. Ковалентное присоединение происходило по однопитевым концам молекулы (через Се гуаниловых остатков). Так получали сорбент с экспонированными, заранее выбранными фрагментами двунитевой ДНК (4). [c.425]

Рис. 15.2. Наборы полос, получаемые при обработке плазмид Ар из разных энтеробактерий рестриктазой Hin [8]. Обработку и электрофорез проводили, как описано в разд. 15.3 2. Гель окрашивали бромистым этидием. Картина люминесценции, возникающая в результате иитеркаляции красителя при освещении ультрафиолетом, сфотографирована на плеику Поляроид .

Интенсивность окраски бромистым этидием зависит от размеров рестриктов зоны крупных рестриктов удается выявить при наличии 30—50 нг в полосе. Для выявления мелких рестриктов необходимо иметь 200—500 нг фрагмента ДНК в каждой полосе. Поэтому для обнаружения всех фрагментов, образующихся при обработке ДНК фага "К рестриктазой Hind П1, необходимо наносить на гель образцы с минимальным (0,3—0,5 мкг) и максимальным (2—5 мкг) количеством ДНК. В последнем случае удается выявить все зоны рестриктов, при этом полосы крупных рестриктов выявляются в виде сильно перегруженных зон, а полосы средних и мелких по размеру рестриктов — в виде тонких, четко разделенных полос. [c.176]

Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, уз-наюшей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является БаиЗМ, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты всевозможных размеров (рис. 4.10). Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. В результате в распоряжении исследователя оказьшается неполная библиотека, что может затруднить или даже сделать невозможным обнаружение искомой [c.63]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

Для концевого мечения ДНК-фрагментов -независимо от характера образующихся после эндонуклеазной обработки концов (5 -, 3 -выступающих или тупых) - можно использовать реакцию замещения, катализируемого ДНК-по-лимеразой Т4. В этом случае к препарату кос-мидной ДНК, обработанной рестриктазой, добавляют ДНК-полимеразу и один меченый дезоксинуклеотид (рис. 20.20). Под действием З -экзонуклеазной активности ДНК-полимера-зы происходит последовательное отщепление 3 -концевых нуклеотидов. Процесс продолжается до тех пор, пока в противопложной цепи не экспонируется нуклеотид, комплементарный меченому дезоксинуклеотиду, добавленному в реакционную смесь. Далее включается полимеразная активность ДНК-полимеразы, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый нуклеотид. Поскольку другие нуклеотиды в реакционной смеси отсутствуют, дальнейшего роста цепи не происходит. [c.463]

Обработка рестриктазой, не расщепляющей кДНК, и электрофорез идентификация фрагментов путем гибридизации с зондами [c.252]

МШ. При обработке ДНК генома рестриктазой, не вносящей разрывов в кДНК, из одного гена с интроном (интронами) может образоваться несколько фрагментов. [c.252]

Совместная обработка рестриктазами Яш<1111 и Нка дает фрагменты длиной 1 и 6,5 т. п. н. Какова ориентация клонируемого фрагмента [c.292]

Рис. 15.24. Доказательство наличия спонтанно инвертируемой последовательности в регуляторной области оперона H2- 1. А. Плазмиду, содержащую клонированную регуляторную область оперона, размножают для получения больщой популяции плазмидных молекул, которые затем линеаризуют обработкой рестриктазой E o R1 (плазмида содержит единственный сайт для E O RI). Далее проводят денатурацию ДНК и отжиг. Б. Образовавшиеся гетеродуплексные молекулы ДНК анализируют с помощью электронного микроскопа. О-образный участок него-мологии,

На рис. 15.2 показаны картины разделения фрагментов плазмидной ДНК, полученных после обработки рестриктазой Hin П. Во всех пробах была обнаружена сходная плазмидная ДНК с мол. массой 5,5-10 . Такой результат свидетельствует о том, что изучаемые плазмиды гомологичны. [c.143]

После обработки рестриктазон мы выделяем чистую ДНК путем депротеинизации фенолом, хлороформом, осал<даем ее этанолом или изопропанолом, промываем 70%-ным этанолом и, наконец, ресуспендируем ДНК в растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1 (pH 7,4) и 1 мМ ЭДТА (ТЭ). Эти общие процедуры, ссылки на которые несколько раз встречаются в этой и следующей главе, приведены в табл. 1.1. Препараты многих рестриктаз загрязнены примесью РНКазы и поэтому использовать их надо с большой осторожностью. В реакции транскрипции конечная концентрация ДНК должна составлять примерно 20— 40 мкг/мл, поэтому для удобства ее следует растворять в ТЭ до конечной концентрации, превышающей 200 мкг/мл. [c.20]

Сортировка X- и Т-хромосом. В работе [333, 330] осуществлена препаративная проточная цитофотометрия X- и У-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой ЕсоК1 и клонирования в фаге (см. разд. 2.3,2,2), У-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии китайский хомячок X человек . Получение клеточных гибридов будет описано в разд, 3,4,3 в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или [c.132]

Обработка рестриктазой I Вв1 I, электрофорез и габридизация с мечеными пробами [c.96]

Специфичность ДНК в местах прикрепления к скелету [125—129]. Все опыты ставятся по очень простой схеме. Клеточные ядра обрабатывают нуклеазами либо специфическими (рестриктазами), либо неспецифическими (микрококковая нуклеаза, ДНКаза I, ДНКаза II), после чего удаляют гистоны и отщепившуюся ДНК тем или иным способом (2 М Na l, детергент, экстракция при низкой ионной силе). Иногда нуклеазная обработка повторяется после этого еще раз. В других случаях удаление гистонов [c.109]

Путем обработки ядерного матрикса разными рестриктазами и экзонуклеазой удалось уточнить структуру зоны связывания. Она состоит из двух участков, защищенных белками от экзонуклеаз, по 200 п. н. каждый, а между ними расположен участок, атакуемый после дегистонизации рестриктазой и экзонуклеазами, длиной около 100 п. н. Области связывания с белками ядерного матрикса содержат много последовательностей, которые узнаются ферментом топоизомеразой II. [c.125]

Смотреть страницы где упоминается термин Рестриктазы, обработка: [c.401] [c.174] [c.176] [c.54] [c.79] [c.451] [c.182] [c.221] [c.303] [c.305] [c.272] [c.228] [c.86] [c.200] [c.41] [c.123] [c.41] [c.155] [c.158] [c.28] [c.126]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология