Плазмиды, варианты интеграции

Чтобы избавиться от такой многоступенчатости, в той же лаборатории разработали иной подход к получению и селекции рекомбинантных вирусов осповакцины, который оказался очень удобным и универсальным для введения инсерций, делеций или мутаций в любую область вирусного генома. В данном случае доминантный маркер gpt находится в гибридной плазмиде вне фрагмента вирусной ДНК, и поэтому он может включиться в вирусный геном только в результате одиночного кроссинговера (рис. 14.33), при котором интегрируется вся гибридная плазмида, а не только вирусный сегмент. (Интеграция из плазмиды чистого вирусного фрагмента является результатом двойного кроссинговера.) Структура генома рекомбинантного вируса, в который встроена вся плазмида, нестабильна из-за наличия протяженных тандемных повторов (например tk или tku см. рис. 14.33), и при снятии селективного давления по гену gpt в результате внутримолекулярной рекомбинации плазмидная часть с геном gpt исключается с высокой эффективностью, а чужеродный целевой ген или вводимое мутационное изменение сохраняется в составе стабильного варианта VA . Этот метод получил название временной доминантной селекции. Используя данный метод, в лаборатории [c.394]

Следует отметить, что ряд исследователей возражают против использования аттенуированного HIV в качестве живой вакцины. Аргументы противников данного подхода состоят в том, что живой вирус, хотя и ослабленный, будет способен рекомбинировать с эндогенными ретровирусными нуклеотидными последовательностями человека и в результате интеграции провирусной ДНК в хромосомы клеток может наблюдаться инсерционный (вставочный) мутагенез. Кроме того, нельзя исключить возможность реверсии аттенуированного штамма к вирулентному варианту. Более того, HIV выращивают на культуре раковых клеток, а биопрепараты, получаемые на таких клетках, не разрешены для использования в медицине. Чтобы обойти данное препятствие, предлагают провирусную ДНК будущего аттенуированного штамма HIV встроить в состав бактериальной плазмиды и выращивать такую гибридную ДНК в бактериальных клетках с последующим выделением ее в высокоочищенной форме. Такую гибридную плазмиду можно будет инъецировать человеку. После попадания в клетку провирусная ДНК будет интегрироваться в хромосомы, а затем с нее будут считываться вирусная геномная РНК и вирусные белки, что приведет к образованию инфекционных частиц HIV. Это и обусловит вакцинацию человека аттенуированным вирусом. [c.445]

Если клетка трансформирована нереплици-рующейся плазмидой, несущей клонированный ген в середине клонированного фрагмента с хромосомным сайтом интеграции, то может произойти спаривание между гомологичными нуклеотидными последовательностями плазмиды и хозяйской ДНК (рис. 6.15, А) и далее интеграция в результате двойного кроссинговера, осуществляемого ферментами клетки-хозяина. Альтернативный вариант — интеграция всей плазмидной ДНК в хромосому хозяина в результате одиночного кроссинговера (на рисунке не показано). Интеграция всей плазмиды может произойти и в том случае, если клонированный [c.123]

Рис, 7,2. Возможные варианты интеграции плазнид. Результатом одиночного рекомбинационного события является единичная интегрированная копия векторной последовательности, ограниченная прямыми гомологичными повторами (а), или же множественные тандемно организованные копии вектора (б). Двойной кроссинговер приводит к замещению хромосомной ДНК гомологичными последовательностями рекомбинантной плазмиды, не сопровождающемуся интеграцией векторных последовательностей (в). [c.214]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Интересная особенность строения генома актиномицетов — явление амплификации части генома. Амплифицированные последовательности (АП) имеют размер от 50 т. п. о. до примерно 0,2 т. п. о. и от 10 до 500 тандемно повторяющихся копий. В сумме они могут составлять до 30 % генома. По крайней мере в некоторых случаях повторяющаяся единица фланкирована прямыми повторами. Возможно, повторы имеют функции IS-элементов. Рекомбинация по прямым повторам может приводить к вариантам, имеющим отличную от исходной локализацию генов, расположенных между ними, вариантам с разным числом копий этих генов и полностью утратившим эти гены. Все это приводит к возникновению мутантных фенотипов. Возможно, это вторая причина помимо интеграции и вырезания плазмид, приводящая к реверсибильной и нереверсибильной генетической нестабильности у актиномицетов. [c.169]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология