Метод Вебера и Осборн

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) позволяет снизить до минимума влияние зарядов белков на их подвижность, которая в этих условиях зависит только от размеров молекул. Под действием ДСН третичная и вторичная структуры белков разрушаются. Для определения молекулярной массы очищенных белков, а также мембран, рибосом и т. д. широко используется метод Вебера и Осборна [80]. ДСН высвобождает и солюбилизирует компоненты этих структур, которые невозможно растворить никаким иным способом. В этом методе используется только одна концентрация геля, и график зависимости относительной подвижности (отношение расстояния, пройденного фронтом красителя, к расстоянию, пройденному зоной белка) от логарифма молекулярной массы имеет линейный харак- [c.272]

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсуль-фата натрия в присутствии р-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли. [c.119]

МЕТОД ВЕБЕРА И ОСБОРН [c.119]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Вебера и Осборна [1379]. Белки инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в растворе, содержащем 0,01 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), 1,% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола если белки проявляют склонность к образованию агрегатов, то к ним добавляют 8 М мочевину. После инкубации белки диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 0,01М нат-рий-фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,1% ДСН и 0,1% 2-меркаптоэтанола. Электродный буфер 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), содержащий 0,1% ДСН. Состав геля 10 /о Т, 2,65% С 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0) 0,1% ДСН 92 мг /о персульфата аммония, 0,15 мл ТЕМЭД на 100 мл раствора. К каждой пробе добавляют 3 мкл 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 1 каплю глицерина и 5 мкл 2-меркаптоэтанола. [c.226]

В методе Вебера и Осборн буферные растворы для приготовления геля и электродный не отличаются между собой. Обычно используют [c.119]

В связи с использованием этих методов возникают некоторые проблемы теоретического характера. Для ряда белков было показано присоединение натрийдодецилсульфата. Предполагается, что этот эффект является основой разделения денатурированных белков при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии детергента. В таком случае необходимо допустить, что индивидуальная картина заряженностн каждой молекулы белка изменяется при связывании анионов натрийдодецилсульфата, так что все макромолекулы становятся отрицательно заряженными. В настоящее время еще трудно сказать, почему белки и сильно различающиеся по аминокислотному составу, и имеющие различные изоэлектрические точки, должны одинаково следовать такой схеме взаимодействия с детергентом. Возможно, что эффект просеивания, описываемый экспоненциальной функцией, преобладает над эффектом заряда. Последний просто не проявляется. В своем исследовании Вебер и Осборн [60] показали, что около 40 различных белков имеют электрофоретические подвижности, не зависящие от изоэлектрической точки и аминокислотного состава (а возможно, и от количества связанного детергента), и скорость их переноса определяется исключительно величинами молекулярных весов их полипептидных цепей. [c.421]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология