ТЕМЭД

Диск-электрофорез в акриламидном геле, содержащем мочевину. Раствор А 8М раствор мочевины (24,0г перекристаллизован-ной мочевины растворяют в 50 мл деионизованной воды и муравьиной кислотой доводят pH до 3,2). Раствор Б 30%-ный цианогум. Раствор В 0,12 мл N, N, N, N -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) в 25 мл раствора А. Раствор Г насыщенный раствор персульфата калия. [c.92]

Добавьте 650 мкл свежеприготовленного 10%-ного персульфата аммония и 100 мкл К,Ы,К, К -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД). Залейте гель, вставьте гребенку (гребенку типа акульи зубы вставляют плоской стороной к гелю). Гель должен полимеризоваться по меньшей. мере в течение 1 ч. [c.32]

Полимеризацию акриламида можно проводить химическим или фотохимическим методом. Наиболее часто применяются следующие системы химических катализаторов а) персульфат аммония — Ы.Ы . М -тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД) б) персульфат аммония — З-Диметилами нопропионитрил (ДМАПН) в) перекись водорода — сульфат железа — аскорбиновая кислота [644]. [c.77]

Фотополимеризацию акриламида осуществляют в присутствии рибофлавина и ТЕМЭД. По сравнению с другими красителями рибофлавин обладает уникальным свойством, заключающимся в том, что входящий в его состав рибозный остаток действует как внутрен ний восстанавливающий агент. В отличие от химической полимеризации фотохимическая реакция требует наличия в С реде следов молекулярного кислорода (около 1 % газовой смеси). Возбужденный светом краситель в при- сутствии донора водорода подвергается восстановлению, а молекулярный кислород окисляет эту восстановленную форму рибофлавина, которая в свою очередь участвует в образовании веществ, необходимых для инициирования полимеризации акриламида [947]. [c.77]

Свойства Акриламид Бис-акриламид ТЕМЭД [c.90]

ТЕМЭД анализируют при помощи газовой хроматографии. [c.93]

Нидлс [907, 908] показал, что белки, аминокислоты и ионы буферных растворов существенно влияют на полимеризацию акриламида. Так, трис и глицинат достаточно эффективно катализируют полимеризацию в отсутствие ТЕМЭД, а белки, наоборот, снижают скорость образования геля, что можно компенсировать повышением содержания ТЕМЭД. [c.99]

При работе с высокими концентрациями акриламида (20% и выше) полимеризация геля часто происходит неравномерно из-за чрезвычайно энергичного выделения тепла [339]. Во избежание этого желательно уменьшить скорость реакции, что осуществляют, либо добавляя в гель феррицианид калия, либо просто исключая из него ТЕМЭД, Для предотвращения набухания поверхности геля рекомендуется [339] повысить концентрацию бис-акриламида и наслоить поверх раствора геля не воду, а изобутанол, который, однако, после завершения полимеризации нужно немедленно удалить, чтобы не вызвать дегидратации геля. Как уже отмечалось выше, скорость и качество полимеризации сильно зависят от условий протекания реакции (буферная система, pH, ионная сила, концент рации катализаторов и инициатора). Поэтому для получения воспроизводимых результатов эти условия необходимо стандартизовать. [c.99]

Причиной искривления полос может быть также слишком быстрая полимеризация геля, приводящая к его неравномерному сжатию и сл ишком сильному прилипанию к стеклянным стенкам. В этом случае целесообразно снизить концентрацию ТЕМЭД или персульфата либо добавить к раствору феррицианид калия. [c.106]

Во многие прописи для приготовления пол иакриламидного геля для ИЭФ входит ТЕМЭД, однако без него вполне можно обойтись. Предполагают, что его роль выполняет смесь веществ, содержащихся в амфолине [868, 1098]. [c.148]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Вебера и Осборна [1379]. Белки инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в растворе, содержащем 0,01 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), 1,% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола если белки проявляют склонность к образованию агрегатов, то к ним добавляют 8 М мочевину. После инкубации белки диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 0,01М нат-рий-фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,1% ДСН и 0,1% 2-меркаптоэтанола. Электродный буфер 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), содержащий 0,1% ДСН. Состав геля 10 /о Т, 2,65% С 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0) 0,1% ДСН 92 мг /о персульфата аммония, 0,15 мл ТЕМЭД на 100 мл раствора. К каждой пробе добавляют 3 мкл 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 1 каплю глицерина и 5 мкл 2-меркаптоэтанола. [c.226]

Система 1 [207]. Ведущий электролит 0,24 М буфер трис-фос-фат (pH 6,1). Замыкающий электролит 0,14 М буфер р-аланин — трис (pH 8). Состав геля 3,7% Т, 3,33% С, 0,5 мг% ри-бофлавина, 0,03 М трис-фосфатный буфер (pH 6,1), 80 мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси, 3,1% сахарозы. Гели длиной 13 см формируют посредством фотополимеризации. Белок растворяют в замыкающем буфере и добавляют к нему 40%- Ный раствор амфолитов-носителей с ИЭТ 5—8 (35 мкл на каждые 10 мкл сыворотки). Изотахофорез проводят в течение 2 ч при поотояниой силе тока ( 2 мА на 1 гель). [c.177]

Система 3 [280]. Применяется для препаративного изотахофореза. 100 мл раствора акриламида [3,67% Т, 5% С, 0,012 М. трис —0,01 ЗМ какодилат (pH 7), 0,25 мг% рибофлавина, Ю мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси] полимеризуют в стеклянной колонке длиной 30 ом (составная часть прибора Унифор фирмы ЬКВ-Рго(1ис1ег АВ). Полимеризация заканчивается после 3 ч облучения. Нижний электродный сосущ, и резервуар для буфера заполняют ведущим электролитом (0,012 М трис —0,013> М какодилат, pH 7), а замыкающий буфер (0,032 М трис — 0,188 М р-аланин, pH 8,95) наливают поверх геля и в верхний резервуар для буфера. Затем через капилляр, расположенный в верхней части прибора, на поверхность геля наносят слой амфолина (40%, ИЭТ 5—7) объемом 2 мл. Устанавливают постоянный электрический ток (10 мА), причем катод должен быть в верх1Н ем электродном сосуде. Через 5 ч после того, как весь амфолин войдет в гель, ток отключают и на поверхность геля через капилляр наносят пробу, состоящую из 2 мл сыворотки, смешанной с 2 мл замыкающего буфера. Затем вновь включают ток (10 мА) и начинают элюцию ведущим буфером. [c.177]

Выявление белков с помощью флуориметрии. Полиакриламидный гель флуоресцирует при длинах волн возбуждающего света 280 или 340 нм. Близкие длины волн возбуждают флуоресценцию соответственно нативных белков (максимум испускания 340 нм) и белков, меченных дансилхлоридом или 8-анилино-1-нафталинсерной кислотой (АНС спектр испускания при 460—520 нм). И хотя максимум спектра флуоресценции геля находится при 415 нм, т. е, довольно далеко от максимального испускания флуоресценции как нативных, так и меченых белков, его широкая полоса в значительной степени перекрывает спектры флуоресценции белков. Для приготовления нефлуоресцирующего геля необходимо добавить к смеси мономеров ди-тиотреитол или заменить ТЕМЭД сульфитом [463]. [c.183]

Аллисон И др. [26] показали, что некоторые аномалии в поведении белков при электрофорезе можно отнести за счет присутствия в геле ТЕМЭД, так как это соединение значительно уменьшает электрофоретическую подвижность белков с молекулярной массой ниже 20000. Указанный эффект можно устранить путем предварительного пропускания тока через гель (преэлектрофореза). [c.224]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Леммли [732]. Пробы, содержащие 62,5 мМ буфер трис-НС1 (pH 6,8), 2 /о ДСН, 10% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанола и 0,001% бромфенолового синего, погружают на 1,5 мин в кипящую воду, Концентрирующий гель 3,08% Т, 2,6% С 125 мМ трис-НС1 (pH 6,8) 0,1% ДСН 0,025% ТЕМЭД 0,025% персульфата аммония. Разделяющий гель 8,22%, Т и 2,6% С или 10,36% Т и 2,6% С 0,375 М буфер трис-НС1 (pH 8,8) 0,1% ДСН, 0,025% ТЕМЭД, 0,025% персульфат аммония. Электродный буфер 0,025М трис —0,0192 М глицин (pH 8,3) 0,1% ДСН. [c.226]

Для разделения белков в первом направлении можно использовать не только электрофорез, но и другие методы. Так, например, Пиндер и Гратцер [1008] описали простой и прямой способ последовательного сочетания центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и электрофореза в геле. Белки сыворотки человека центрифугировали в градиенте 0—40%-ного раствора сахарозы, содержащего 5% акриламида (2,5% составлял бас-акриламид), ТЕМЭД, (1 мг/мл) и рибофлавин (50 мкг/ /мл). После центрифугирования пробирки облучали люминесцентной лампой для полимеризации акриламида. Чтобы видеть, результаты центрифугирования, один из параллельных гелей окрашивали амидовым черным. Затем из центральной части неокрашенного геля вырезали полоску шириной 2 мм и использовали ее как стартовую зону для электрофореза на пластине 57о-но-го полиакриламидного геля при pH 8,5. [c.234]

Для обнаружения супероксиддисмутазы была использована реакция НТС с Оа [96]. Вначале гели выдерживали 20 мин в 2,45-10 М растворе НТС, а затем погружали на 15 мин в раствор, содержавший 28 мМ ТЕМЭД, 0,028 мМ рибофлавин и 36 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,8. Далее гели помещали в сухие пробирки и оставляли на свету на 5—10 мин в результате гели приобретали синюю окраску, за исключением зон, содержавших супероксиддисмутазную активность, которые оставались бесцветными. [c.291]

Электрофорез по Боннеру и др. [14S. Разделяющий гель 15,1% Т и 0,66% С или 7,7% Т и 2,6% С 0,375 М ацетат калия (pH 4,3), 0,5% ТЕМЭД, 0,125% персульфата аммония, 6,25 М мочевина. Электродный буфер 0,35 М р-аланин — 0,14 М ук-сусная кислота. Образцы растворяют в 10 М мочевине и наслаивают на гель. [c.307]

Невил [921] использовал неоднородную буферную систему. Разделяющий гель 7,2% Т, 2,77% С, 0,58 М уксусная кислота, 7,5 мМ КОН (pH 2,7), 9 М мочевина, 0,0004% рибофлавина, 0,05% персульфата аммония, 0,08% ТЕМЭД. Концентрирующий гель 1,95% Т, 11,4% С, 0,065 М уксусная кислота, 0,06 М КОН (pH 5,9), 7 М мочевина, 0,0004% рибофлавина, 0,05% персульфата аммония. Верхний электродный буфер 0,11 М глицин, 0,016 М уксусная кислота (pH 4,0), 6 М мочевина. Нижний электродный буфер 4,6 М уксусная кислота, 0,06 М КОН (pH 2,7). Образцы содержали 8 М мочевину, 0,05 М К2СО3, 10% 2-меркаптоэтанола и следы метилового зеленого. [c.317]

Миро и др. [876] применяли гели с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида, приготовленные в кварцевых трубках. Это дало возможность проводить прямое денситометрическое сканирование гелей. Чтобы обеспечить стабильность градиента концентрации акриламида во время полимеризации, создавали параллельный градиент концентрации глицерина. ТЕМЭД и персульфат добавляли в концентрациях обратно пропорциональных концентрации акриламида. Гели готовили на буфере, содержащем триэтаноламин, ацетат натрия и ЭДТА (pH 7,4). Электродные резервуары наполняли тем же буфером с добавлением глицерина, ДСН и дезоксихолата. Ядрышковые РНК из клеток НеЬа наносили на гель в объеме 50 и 800 мкл. Если электрофорез продолжался в течение 9 ч, то разделение было лучше в пробе с объемом 50 мкл, однако через 18 ч в обоих случаях были получены одинаково хорошие результаты (рис. 121). Изучение кинетики электрофоретической миграции показало, что в градиентном геле разные виды РНК движутся с той же относительной скоростью, что и в однородном геле. При использовании экспоненциального градиента концентрации от 1,8 до 15% можно в один прием разделить все клеточные РНК и определить их молекулярные массы. [c.379]

Бурк и Нейлор i[154] предложили использовать ТЕМЭД вместо ДМАПН, так как, по нх мнению, в гелях, образованных в присутствии ТЕМЭД, нуклеиновые кислоты разделяются лучше. [c.381]

Персульфат аммония и л ТЕМЭД хранят при 4°С. [c.58]

Трис Концентриропзннгя КС (доводят pH до 7,0) Дистиллированная вода до 100 мл Другие компоненты геля 10 %-ный раствор (вес на объем) ДСН в дистиллированной воде Катализатор 10%-ный раствор (вес иа объем) персульфата аммония в дистилли рованиой воде — готовят свежий раствор непосредственно перед применением ТЕМЭД (длительно не хранят) Электродный буфер (pH 8,3) 12,1 г [c.60]

Затем в легкий сосуд вносят 60 мкл ТЕМЭД и заливают его содержимое в правую камеру аппарата для создания градиента. Аппарат наклоняют, чтобы раствор мог попасть в систему трубок. При этом стараются, чтобы пузырьки воздуха поднимались и выходили из трубок. В тяжелый сосуд добавляют 10 мкл ТЕМЭД и выливают его содержимое в левую камеру аппарата для создания градиента. При. этом большого числа [c.209]

С приготовленного разделяющего (нижнего) геля отсасывают всю жидкость н на глубину 1,5 см вставляют гребешок , формирующий карманы для образцов (таким образом, между этими карманами и верхним краем разделяющего геля остается расстояние по крайней мере в 1,5 см). Смесь концентрирующего геля дегазируют и после добавления ТЕМЭД (0,001 объема) наносят пипеткой на дно выемкн в стеклянной пластинке, после чего заливают его сверху бутанолом, насыщенным водой, и оставляют иа 30—60 мнн для полимеризации прн комнатной температуре. Удаляют гребешок и промывают концентрирующий гель верхним буфером с ДСН. После этого камера готова для нанесения образца и электрофореза (см. разд. И1). [c.75]

ЧТО делает пластинки геля более удобными для обработки. Помеле дегазации и добавления ТЕМЭД смесь заливают между двумя стеклами без выемок. Далее делают все так же, как при полимеризации столбиков геля для электрофокусироваиня. [c.83]

Персульфат аммония применяют вместе с ТЕМЭД в качестве источника свободных радикалов при химической полимеризации акриламида. Водный раствор персульфата аммония (10%) готовят ежедневно, так как это вещество быстро разрушается при комнатной температуре. [c.97]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология