Автоматическое секвенирование ДНК

В настоящее время при секвенировании ДНК также широко применяются различные флуоресцентные красители, однако детекция такой ДНК предполагает наличие сложного дорогостоящего оборудования, каковыми являются автоматические секвенаторы ДНК и поэтому подробное рассмотрение флуоресцентных меток будет проведено в специальной главе, посвященной автоматическому секвенированию ДНК. [c.108]

ПРОВЕДЕНИЕ ТЕРМИНИРУЮЩИХ РЕАКЦИЙ ПРИ АВТОМАТИЧЕСКОМ СЕКВЕНИРОВАНИИ ДНК ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ [c.311]

ТЕРМИНИРУЮЩИХ РЕАКЦИЙ В АВТОМАТИЧЕСКОМ СЕКВЕНИРОВАНИИ ДНК [c.320]

Принцип автоматического секвенирования ДНК заключается в электрофоретическом разделении флуоресцентно меченных продуктов специфически терминированных секвенирую-щих реакций и их детекции в режиме реального времени. Детекция осуществляется в нижней части геля, где в момент прохождения фрагментов ДНК происходит возбуждение молекул красителя лазерным лучом. [c.42]

Серьезное значение в автоматическом секвенировании ДНК приобретает точность определения нуклеотидной последовательности, поскольку в большинстве случаев экспериментатор не участвует в процессе ее чтения и занесения в компьютер. [c.44]

В автоматическом секвенировании ДНК для разделения флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций, кроме электрофореза в стандартных пластинах полиакриламидного геля, широко используется капиллярный гель-электрофорез. Для него характерны высокая чувствительность и высокая скорость разделения, являющиеся следствием крайне малого внутреннего диаметра самого капилляра. [c.44]

Хотя сам принцип специфической терминации, положенный в основу первоначального метода секвенирования ДНК с помопц.ю дидезок-ситерминаторов, остался неизменным, само секвенирование ДНК по Сэнгеру все же стало в значительной степени другим. Причем для описания всех этих последовательных усовершенствований одной главы оказалось недостаточно и, кроме главы 2, целиком посвященной этому методу, еще ряд глав (глава 3. ПЦР-секвенирование ДНК глава 9. Автоматическое секвенирование ДНК) имеют к ферментативному методу секвенирования ДНК самое непосредственное отношение. Разработки векторов для молекулярного клонирования и стратегий секвенирования (главы 7 и 8 соответственно) также в большей степени ориентированы на ферментативное секвенирование. В связи с разделением нами в главе 7 векторов для молекулярного клонирования на несколько поколений следует отметить, что оно, конечно же, условно хотя бы по той причине, что огромная группа специализированных векторов оказалась не включенной в приведенную схему. Подробное рассмотрение стратегий секвенирования объясняется тем, что именно от их выбора часто зависит общая производительность метода секвенирования ДНК. [c.10]

Нельзя не упомянуть о недавно предложенной уникальной гребенке, позволяющей осуществить одновременное быстрое, занимающее всего несколько минут, нанесение 200 образцов на полиакриламидный гель шириной 30 см [Erfle et al., 1997]. Эффективность данной гребенки была продемонстрирована при автоматическом секвенировании ДНК в двух различных приборах, хотя авторы утверждают о возможности ее применения как для вертикальных, так и горизонтальных гелей ультра-тонкой и стандартной толщины. Особенностью этой гребенки является то, что она изготовлена из пористого материала и поэтому образцы ДНК предварительно наносятся на каждый зубец гребенки, впитываются в него и уже затем гребенка с препаратами ДНК, находящимися в зубьях, втыкается в гель. Под действием электрического тока препараты ДНК выходят из гребенки и входят в полиакриламидный гель. [c.179]

Для проведения секвенирующего гель-электрофореза фрагментов ДНК, кроме специально изготовленной камеры, которая может быть весьма простой и способной только поддерживать стекла с залитым между ними гелем, даже не обеспечивая при этом отвод выделяющегося в процессе электрофореза тепла, необходим высоковольтный источник питания. Для эффективного разделения в полиакриламидном секвенирующем геле фрагментов ДНК подаваемое напряжение должно быть в пределах от 30 до 50 В на см длины геля и, учитывая его большой размер, источник питания должен обеспечивать стабилизацию напряжения не менее 2000 В. Для более эффективного разделения фрагментов ДНК и повышения общей производительности метода можно порекомендовать приобретение фабрично изготовленного прибора, в котором предусмотрено и определенное удобство заливки геля и дальнейшего обращения с ним, и равномерное распределение Джоулева тепла во время электрофореза, и комплект запасных спейсеров и гребешков. Выбор подобных аппаратов, включая автоматические секвенаторы ДНК, достаточно велик, но и их стоимость весьма существенна. Однако следует отметить, что для осуществления небольших проектов секвенирования ДНК не обязательно приобретать дорогостоящие автоматические секвенаторы (хотя в последнее время появились относительно недорогие модели, о которых речь пойдет в главе, посвященной автоматическому секвенированию ДНК). [c.181]

Первые успехи в автоматизации секвенирования ДНК, пожалуй, можно связать с полуавтоматическими и автоматическими методами. чтения последовательности нуклеотидов с радиоавтографа секвенирующего геля или даже еще с более ранней автоматической обработкой и анализом последовательности нуклеотидов с помощью компьютеров и специализированных программ. Однако в настоящее время под автоматическим секвенированием ДНК понимается, в первую очередь, электрофоретическое разделение флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов - автоматических секвенаторов ДНК. Другой аспект автоматизации процесса секвенирования ДНК заключается в наработке матриц для их последующего ферментативного секвенирования, а также проведении секвенирующих реакций (как в ферментативном методе, так и в методе химической деградации) с помощью лабораторных биороботов. [c.309]

При автоматическом секвенировании ДНК в качестве матриц наиболее часто применяются одно- или двуцепочечные молекулы фагов, плазмид или фагмид (кроме ПЦР-продуктов, которые представляют собой отдельный тип матриц для секвенирования). Выделение требуемого большого количества подобных образцов представляет собой некоторую проблему. Так, в работе Эперона сообщалось об изготовлении специальной установки, рассчитанной на одновременное выделение 96 таких образцов с помощью фильтрации [Ерегоп, 1986]. Выделенные таким образом одноцепочечные препараты ДНК на основе фага М13 показали высокое качество секвенирования, сравнимое с матрицами, получаемыми обычным путем с использованием того же полиэтиленгликоля в качестве осадителя фаговых частиц. Впоследствии этот метод был слегка модифицирован [Ерегоп et al., 1988]. Предложенные в этих [c.309]

В автоматическом секвенировании ДНК применяются различные высокопроцессивные ДНК-полимеразы. Выбор конкретной из них во многом зависит от температурных особенностей проводимых терминирующих реакций. Следует отметить, что весьма широкое применение для секвенирующих реакций, проводимых с помощью биоробота, находит фермент Bst ДНК-полимераза из-за ее высокой стабильности при комнатной температуре в отличие от секвеназы. Так, в ряде работ показано высокое качество получаемых результатов при использовании этого фермента для проведения секвенирующих реакций с помощью лабораторного робота [Earley et al., 1993 1994]. В последней работе авторами было проведено сравнение двух ДНК-полимераз - секвеназы и [c.311]

Несмотря на то, что для автоматического секвенирования ДНК подбираются красители с отличающимися спектрами эмиссии, все же полностью избежать перекрытия не удается. Один подход к решению данной проблемы заключается в синтезе все новых флурофоров с улучшенными спектральными характеристиками. Другой же состоит в недавно предложенном способе детекции не спектра эмиссии конкретного соединения, а времени его флуоресценции, измеряемой в наносекундах [Nunnally et al., 1997]. Так, после анализа различных красителей были выбраны наиболее подходящие для этой цели и в модельном эксперименте продемонстрирована их пригодность для автоматического секвенирования ДНК. Авторы отмечают, что такая характеристика флуорофоров, как продолжительность свечения, более дискретна для большинства красителей, нежели их спектры испускания света. Особую актуальность данный подход приобретает в связи с мультиплексным секвенированием ДНК, где необходимо одновременно разделять несколько по-разному меченных образцов [Не et al., 1998]. Так, другими авторами за счет детекции времени флуоресценции ряда красителей было осуществлено мультиплексное секвенирование ДНК, показавшее точность свыше 90% для 660 нуклеотидов [Lieberwirth et al, 1998]. [c.314]

Для автоматического секвенирования ДНК, как и для обычного, применяют и внутреннее мечение с помощью несущих флуоресцентную молекулу различных дНТФ, и 5 -концевую метку в виде олигонуклеотидного праймера с флуорофором и 3 -концевую метку, образующуюся за счет терминации синтезируемых цепей ДНК ддНМФ, со дер- [c.314]

Постоянно продолжается работа над усовершенствованием систем для автоматического секвенирования ДНК. Так, недавно предложено использование оптоволоконной техники для подачи возбуждающего луча лазера и сбора сигналов флуоресценции, что позволило исключить применение многочисленных зеркал и линз, требующих весьма частой настройки, причем всей системы сразу [Trost, Guttman, 1998]. В случае же использования оптических волокон настройка каждой части может осуществляться независимо. Более того, в своей статье авторы сообщают, что используемые ими около 6 мес подобные системы не потребовали в этот период какой-либо дополнительной регулировки. [c.322]

Многие компьютерные программы, рассчитанные на сбор первичных данных при автоматическом секвенировании ДНК, к сожалению, учитывают только информацию о высоте пиков флуоресценции, приходящихся на конкретный нуклеотид. С целью повышения достоверности определяемых этим методом нуклеотидных последовательностей было предложено принимать в расчет не только пики, а также впадины между ними, но и формы кривых, их формирующих [Allex et al., 1996]. Этими авторами и пикам и впадинам, исходя из их характера, были присвоены свои классификации, как сильный(ая), средний(яя) и сла-бый(ая). Разработанная программа, позволяющая обрабатывать первичный материал в виде пиков флуоресценции секвенируемой ДНК при ее разделении в автоматическом секвенаторе ABI 377, оценивала все эти параметры. Так, было показано, что при чтении конкретных нуклеотидов в виде принадлежащих им пиков флуоресценции и с учетом [c.324]

Все описанное выше в этой главе относилось к автоматическому секвенированию ДНК ферментативным методом по Сэнгеру. Что касается секвенирования путем химической деградации по Максаму-Гил- [c.329]

Под автоматическим секвенированием ДНК понимается в первую очередь электрофоретическое разделение меченых продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов — автоматических секвенаторов ДНК. Автоматизации с помощью лабораторных биороботов подвергаются также процесс наработки матриц для их последующего ферментативного секвенирования и проведение секвени-рующих реакций. Первый автоматический ДНК-секвенатор был разработан в 1987 г. фирмой Applied Biosystems (США). [c.42]

Так, в настоягцее время использование флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов ограничивается, главным образом, автоматическим секвенированием ДНК, проведением ПЦР в режиме реального времени, а также анализом экспрессии генов с помогцью ДНК-чипов. При этом можно уверенно прогнозировать, что, по крайней мере, для последних двух подходов применение меченных флуорохромами олигонуклеотидов будет расти весьма быстрыми темпами. В особенности следует ожидать увеличения объема медицинских анализов, где использование флуоресцентных ДНК-чипов в будугцем станет совсем обычным делом. [c.63]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология