Клонирование и секвенирование ДНК

Таким образом, с помощью данной конструкции можно проводить клонирование, секвенирование и экспрессию генов под контролем сильных промоторов, а также прямой отбор рекомбинантов и сайт-специфический мутагенез. [c.154]

В последнее десятилетие мы стали свидетелями целой серии ошеломляющих успехов в области молекулярной биологии. Разработка надежных методов клонирования, секвенирования и анализа экспрессии эукариотических генов углубила наши представления о структуре и регуляции активности гена, сделала более понятными механизмы многих наследственных болезней человека, В это же время быстро развивались и достигли значительных успехов методы картирования человеческих генов. В сентябре 1987 г. в Париже состоялась конференция по проблеме картирования генома человека. На ней было доложено о локализации в общей сложности 1360 генов и сегментов ДНК в специфических участках хромосом. Процесс накопления данных в этой области носит лавинообразный характер. Заметим, однако, что при этом исследования по молекулярному клонированию и картированию с помощью анализа сцепления и методами генетики соматических клеток находятся на разных операционных уровнях (рис. 1). [c.95]

За более чем столетнюю историю изучения о ДНК накоплена масса сведений, часть из которых нашли свое отражение в данной брошюре. Наибольшее внимание уделено результатам исследований последних десятилетий, ставших возможными благодаря открытию двойной спирали ДНК, разработке методов клонирования, секвенирования, олигонуклеотидного синтеза, сайт-направленного мутагенеза, полимеразной цепной реакции, за которые в разные годы были присуждены Нобелевские премии. Приводятся подходы и перспективы дальнейшего изучения и использования молекул ДНК в различных отраслях науки и человеческой деятельности. [c.2]

Современное руководство по биотехнологии, написанное авторитетными канадскими учеными. В книге подробно изложены основы генной инженерии механизмы репликации, транскрипции и трансляции методы клонирования, амплификации и секвенирования ДНК конструирование рекомбинантных ДНК введение последовательностей-мишеней в геном микроорганизмов, растений и животных, а также практическое применение генной инженерии для получения лекарственных веществ, вакцин, факторов роста, инсектицидов и т.д. Большое внимание уделено генной терапии и связанным с ней морально-этическим проблемам, патентованию биотехнологических продуктов и способов их получения. [c.4]

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

Секвенирование ДНК с помощью вектора на основе фага М13 Для определения нуклеотидной последовательности клонированных ДНК используются разные подходы. Один из первых основывался на [c.91]

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

Секвенирование фрагмента клонированной ДНК длиной 250—350 нуклеотидов. [c.94]

К числу наиболее важных для молекулярной биотехнологии методов, помимо клонирования генов, относятся методы химического синтеза ДНК, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР). [c.102]

Для секвенирования используют также систему на основе фага М13. В ДНК фага встраивают фрагмент ДНК длиной до 500 нуклеотидов, который хотят секвенировать. Эту рекомбинантную ДНК легко получить в одноцепочечной форме и использовать ее в качестве матрицы для секвенирования вставки. Можно использовать также двухцепочечные плазмиды, содержащие клонированную ДНК. [c.103]

Если онкоген клонирован и секвенирован, то указания на вероятную функцию соответствующего гена социального контроля (протоонкогена) часто можно найти, сравнивая последовательности нуклеотидов данного онкогена и уже известных генов. Именно таким путем было открыто. [c.429]

Больше всего известно об аминокислотной последовательности субъединиц с высокой молекулярной массой, изолированных Филдом и др. [79] (молекулярная масса, определенная с помощью ДДС-Ыа-ПААГ, — 144 ООО, ультрацентрифугированием — 69 600 Да). Действительно, установлена последовательность из 16 аминокислот N-концевой половины цепи она была определена при секвенировании изолированного белка [79]. Кроме того, благодаря клонированию ДНК, кодирующей эту субъединицу, и определению ее нуклеотидной последовательности стало возможным установить последовательность из 101 аминокислоты у СООН-концевой половины цепи [81] (см. табл. 6Б.15). Анализ последовательности N-концевой половины цепи подтверждает предыдущие результаты она не соответствует ни одной из тех последовательностей, которые были предварительно идентифицированы для а-, Р-, 7- и й)-глиадинов или агрегированных глиадинов. Эта аминокислотная последовательность N-концевой половины цепи по составу очень отличается от аминокислотного состава полного белка меньше неполярных аминокислот, глицина, а также глутаминовой кислоты и глутамина. Отмечается также отсутствие серина, тогда как все основные аминокислоты присутствуют. Поэтому такая последовательность не является представительной для первичной структуры всей полипептидной цепи, которая должна содержать зоны, более богатые глицином и бедные глутамином. Наконец, примечательно наличие 2 цистеинов из 5 или 6, которые входят в состав целой молекулы, так как оно с большой вероятностью предопределяет конформацию молекулы, как и возможности образования внутрицепочных дисульфидных мостиков. Опыты с разрывом полипептидной цепи на уровне цистеинов подтвердили, что большинство из них должно располагаться у концов цепи [79]. В самом деле, обнаруживается третий цистеин в положении 13 у С-конца [81]. Эта С-кон- [c.210]

S РНК Е. oli была первой высокополимерной рибосомной РНК, полная первичная структура которой была установлена. Это было сделано как прямым химико-энзиматическим анализом нуклеотидной последовательности РНК в группе Ж. -П. Эбеля, так и путем секвенирования ДНК соответствующего клонированного гена в груп- [c.70]

Первичная структура рибосомной 23S РНК Е. соИ также была установлена как ее прямым химико-энзиматическим анализом, так и путем секвенирования ДНК ее клонированного гена (рис. 44). Одновременно и некоторое время спустя были секвенированы также высокополй-мерные РНК большой рибосомной субчастицы ряда других организмов, а также хлоропластов и митохондрий, которые дали материал Для сравнительно-эволюционного анализа. Весь арсенал методов, примененный в случае 16S РНК, был использован для изучения вторичной структуры 23 S РНК, и были найдены принципиально те же закономерности и особенности. Схема модели вторичной структуры 23S РНК Е. соН дана на рис. 45. Как и в 16S РНК, около половины или более остатков цепи 23S РНК оказываются вовлеченными в двойные спирали. Всего можно насчитать несколько более 100 индивидуальных спиралей. Наиболее ярким отличием от 16S РНК является, по-видимому, комплементарное спаривание 5 -конца 23S РНК с ее З -концом довольно стабильная совершенная двойная спираль из 8 пар нуклеотидов удерживает оба конца вместе, в значительной мере фиксируя общую свернутость цепи в конечную компактную структуру. Как и в 16S РНК, пары G U не редкость в спиралях 23S РНК. Кроме того, в спиралях имеются пары G А и, [c.77]

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Подбор второго праймера, комплементарного концевому участку уже секвениро-ванной последовательности длиной примерно 20 нуклеотидов. 4. Секвенирование следующего сегмента клонированной ДНК с помощью второго праймера (Р2). 5. Подбор третьего праймера, комплементарного концевому участку этого сегмента размером 20 нуклеотидов. 6. Третий праймер (РЗ) используется для секвенирования следующего сегмента клонированной ДНК. Эту процедуру продолжают до тех пор, пока не будет секвенирована вся вставка. [c.94]

Метод ПЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесения специфических мутаций in vitro, сборки полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов, секвенирования ДНК. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продук-та. Однако прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, по- [c.97]

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов один из них - ди-дезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует 3 "-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая - в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и считывают с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК. [c.103]

Для определения нуклеотидной последовательности протяженных клонированных сегментов сначала подбирают синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный участку, соседствующему со вставкой, и с помощью диде-зокси-метода секвенируют первые 250-300 нуклеотидов. Затем по результатам секвенирования синтезируют второй праймер и определяют последовательность следующих 250-350 нуклеоти- [c.103]

Праймер-опосредованная прогулка ( блуждающая затравка ) (Primer walking) Один из методов секвенирования протяженных сегментов ДНК (>1 т.п.н.) с использованием праймера (затравки), комплементарного концу уже известной последовательности. На основании данных, полученных на первом этапе, синтезируют новый праймер, перекрывающийся с концом уже секвенированного участка, и используют его для определения нуклеотидной последовательности следующего участка клонированной ДНК. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не секвенируют весь сегмент. [c.545]

Третьим достижением стала разработка методов клонирования ДНК (гл. 30), которые сделали возможным получение достаточно больших количеств чистьгх генов-исходного материала для секве-нирования. Было предложено два принципиальных подхода к секвенированию ДНК, у каждого из которых есть ряд вариантов. Фредерик Сэнгер, первым определивший аминокислотную последова- [c.887]

Методы клонирования и секвенирования ДНК позволили провести тщательный сравнительный анализ генетической организации митохондриальных геномов у целого ряда организмов, от грибов до человека. Определение полной нуклеотидной последовательности человеческой митохондриальной ДНК, содержащей 16 569 нуклеотидных пар, было завершено в 1981 г. Известны также частичные последовательности митохондриальных геномов быка, дрожжей и Neurospora. Полученные результаты свидетельствуют о том, что митохондриальные геномы высших и низших эукариот, кодирующие примерно один и тот же набор функций, в то же время характеризуются различиями в смысловом значении некоторых кодонов, в правилах антикодон-кодонового узнавания и существенными различиями в общей структурной организации. Можно полагать, что существенным фактором эволюции митохондриальных геномов была селекция на максимальную структурную компактность при максимальной информационной нагруженности (см. Дополнение 12.1). Это, вероятно, достигалось за счет таких изменений генетического кода, которые позволили сократить необходимый для считывания набор тРНК. При этом митохондрии млекопитающих, характеризующиеся наиболее компактной организацией генома, подверглись соответ- [c.95]

Усовершенствование техники секвенирования белка значительно повысило его скорость и чувствительность, позволяя анализировать минимальные количества образца. Например, в настоящее время последовательность из нескольких десятков аминокислот можно выяснить, имея в распоряжении всего несколько микрограммов белка - количество, извлекаемое из одной полосы ДСН-полиакриламидного геля. Это оказалось крайне важно для изучения многих минорных белков клетки, например, рецепторов стероидных или полипептидных гормонов. В настоящее время достаточно определить в белке 20 аминокислот, чтобы сконструировать ДНК-зонд, используемый для клонирования соответствующего гена (см. разд. 5.6.5) После вьшеления гена оставшаяся невыясненной часть аминокислотной последовательности белка может быть реконструирована по нуклеотидной последовательности согласно генетическому коду. Это можно считать значительным достижением, поскольку даже с полной автоматизацией определение полной первичной последовательности белка остается крайне сложной задачей. Так, например, если белок состоит из 100 аминокислот, их последовательность, если очень напряженно трудиться, можно установить за месяц. Но с удлинением цепи аминокислот сложности нарастают очень быстро, что не позволяет превратить процесс определения аминокислотной последовательности в рутинную методику. Учитывая то обстоятельство, что секвенирование ДНК - процедура более легкая и занимает меньше времени (см. ниже), в настоящее время последовательность аминокислот в большинстве белков, как правило, определяют по нуклеотидной последовательности соответствующих генов. [c.220]

Опухоли часто возникают не от вирусной инфекции, а в результате мутаций, происходящих случайно или же под действием химических канцерогенов или облучения. Из таких опухолевых клеток можно получить очищенную ДНК и проверить ее на наличие онкогенов путем введения в нетрансформированные клетки в культуре in vitro. Для такого теста часто используют клетки ЗТЗ, поскольку они неопределенно долго делятся в культуре и содержат мутации, благодаря которым их легко трансформировать добавлением всего лишь одного онкогена. Онкоген, ответственный за такую трансформацию, может быть выделен, клонирован и секвенирован с помощью метода рекомбинантной ДНК (рис. 13-33). Нримечательно, что в большинстве случаев, когда это было сделано, онкоген оказывался мутантной формой одного из тех самых протоонкогенов, которые были выделены с использованием ретровируса, хотя при этом было открыто и несколько новых онкогенов. [c.428]

Наилучший способ определения структуры вирусной геномной РНК — анализ провирусной ДНК-формы генома, присутствующей в инфицированных клетках, например, с помощью блот-гибридизации клеточной ДНК [39]. На рис. 9.5 показан вариант такого анализа, демонстрирующий удаление интронов из гека, клонированного в ретровирусном векторе. Как правило, клеточную ДНК расщепляют рестриктирующими ферментами, которые узнают специфические сайты в пределах каждого из вирусных LTR, но не затрагивают внутренние последовательности так, в случае векторов семейства Mo-MLV для этой цели часто используют рестриктазы Xbal и 5ас1. Следует подчеркнуть, что в тех случаях, когда инфицированные клетки имеют мышиное происхождение, гибридизационная проба для блот-анализа не должна содержать MLV-последовательностей. В противном случае родственные MLV эндогенные провирусы ослож- нят интерпретацию картины гибридизации. При необходимости проводят детальное структурное картирование или секвенирование ДНК рекомбинантного провируса, используя клонированную провирусную ДНК. [c.299]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Для завершения картирования необходимы были выводы, основанные на размере РНК-белка. Однако не было получено подтверждающих данных ни при исследовании трансляции мРНК in vitro 95], ни при олигонуклеотидном картировании изолированных сегментов РНК [138], ни при пептидном картировании белков или при секвенировании РНК (обзор этих материалов см. в работе [132]), когда достаточная консервативность структуры позволяет легко идентифицировать ген или продукт гена как М, NP или NS. Окончательные доказательства были получены только после изучения генного клонирования и экспрессии (см. главу 6). [c.19]

Хотя ДИ частицы вируса гриппа впервые были выявлены около 30 лет назад [64, 65], детально их свойства изучены совсем недавно. Отдельные сообщения о свойствах ДИ частиц вируса гриппа и их геномах были представлены ранее [48, 50]. С этого момента с использованием техники клонирования и секвенирования ДНК были определены полные последовательности прогениторных генов (РВ1, РА и РВ2) и число ДИ РНК. Поэтому в настоящей главе основное внимание уделено анализу современных данных по структуре ДИ РНК и их связи с прогениторными генами. [c.249]

Недавно был полностью секвенирован ряд ДИ РНК белка РВ1 и РВ2, и впервые представлена, таким образом, информация о специфической связи ДИ РНК с прогениторным геном на уровне нуклеотида. Однако следует быть осторожными в интерпретации последовательностей, полученных только с использованием техники клонирования ДНК, из-за возможности перестройки последовательности во время клонирования [26]. [c.260]

ДИ частицы вируса гриппа, продуцируемые при высокой множественности заражения, содержат молекулы ДИ РНК, которые относятся к 5 —З типу и возникают из внутренних делеций одного из генов полимеразы. Они могут быть транскрибированы в поли (А)-содержащие комплементарные РНК, имеющие характеристики РНК стандартного вируса. Структура ДИ РНК вируса гриппа и их возможная функция (т. е. транскрипция) оказываются отличными от соответствующих характеристик 5 ДИ РНК, которые представляют большинство несегментированных минус-цепочечных ДИ РНК. Хотя клонирование ДНК и секвенирование помогло в расшифровке первичной структуры ряда ДИ РНК и их прогениторных генов, специфические этапы, вовлеченные в зарождение и эволюцию ДИ РНК вируса гриппа, а также механизм интерференции остаются еще во многом неразрешенными и будут являться предметом исследования на ближайшие годы. [c.269]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология