Секвенирование ДНК ферментативным методом по Сэнгеру

Что касается ферментативного секвенирования ДНК по Сэнгеру, то этот метод изменился за эти годы весьма сильно и разработанные стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК оказали заметное влияние на его общую производительность. Большинство существующих стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом основаны на получении серии субклонов. Различают два главных подхода к их получению, один из которых считается случайным, а другой направленным. В основе стратегий случайного подхода лежит произвольная фрагментация ранее клонированного фрагмента ДНК и дальнейшее получение субклонов с небольшими вставками в другом векторе (а не в исходном), причем их размер, как правило, позволяет осуществить определение нуклеотидной последовательности всего субклонированного фрагмента за один эксперимент без дополнительного этапа субклонирования. Стратегии направленного подхода предполагают создание серии субклонов обычно в составе исходного вектора, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера), и прогрессивно удаляющимися местами вставки. И тот и другой подходы имеют как свои преимущества, так и недостатки, к рассмотрению которых мы и перейдем. [c.240]

В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977а], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежал принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. [c.46]

Первый метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном в 1975 г, основан на ферментативных реакциях и носит название плюс-минус -метод. Данный подход предполагает выделение одноцепочечного фрагмента ДНК, соответствующего исследуемому участку генома. Этот фрагмент используют затем в реакции полимеразного копирования в качестве матрицы, а в качестве праймера — синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые после гидролиза определенными рестриктазами. [c.36]

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ ПО СЭНГЕРУ [c.44]

Хотя сам принцип специфической терминации, положенный в основу первоначального метода секвенирования ДНК с помопц.ю дидезок-ситерминаторов, остался неизменным, само секвенирование ДНК по Сэнгеру все же стало в значительной степени другим. Причем для описания всех этих последовательных усовершенствований одной главы оказалось недостаточно и, кроме главы 2, целиком посвященной этому методу, еще ряд глав (глава 3. ПЦР-секвенирование ДНК глава 9. Автоматическое секвенирование ДНК) имеют к ферментативному методу секвенирования ДНК самое непосредственное отношение. Разработки векторов для молекулярного клонирования и стратегий секвенирования (главы 7 и 8 соответственно) также в большей степени ориентированы на ферментативное секвенирование. В связи с разделением нами в главе 7 векторов для молекулярного клонирования на несколько поколений следует отметить, что оно, конечно же, условно хотя бы по той причине, что огромная группа специализированных векторов оказалась не включенной в приведенную схему. Подробное рассмотрение стратегий секвенирования объясняется тем, что именно от их выбора часто зависит общая производительность метода секвенирования ДНК. [c.10]

Наиболее широко сейчас применяется метод ферментативного секвенирования, или метод секвенирования путем терминации (остановки синтеза) цепи, предложенный Ф. Сэнгером в 1977 г. (рис. 1.3, а). В основе [c.30]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Пожалуй, ключевым моментом ферментативного метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977], является образование специфически терминированных меченых фрагментов вновь синтезированной ДНК. Такая терминация построения комплементарной цепи ДНК происходит при включении ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК-модифицированных аналогов природных [c.109]

В ферментативном методе секвенирования ДНК по Сэнгеру каждая дорожка соответствует только одному конкретному типу оснований (рис. 6.2) и поэтому для правильного прочтения радиоавтографа секвенирующего геля необходимо следить, чтобы какая-либо полоса содержалась только в одной дорожке, поскольку в противном случае точное установление данного нуклеотида будет затруднено или скорее просто невозможно. В связи с тем, что в отличие от картины полос секвенируемой ДНК по Максаму Гилберту в методе Сэнгера нет необходимости сопоставления наличия полос пуриновых или пиримидиновых оснований в одной или двух дорожках, то можно считать, что чтение радиоавтографа секвенирующего геля при этом будет несколько проще. [c.200]

СТРАТЕгаИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРОТЯЖЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ ПО СЭНГЕРУ С ПОМОЩЬЮ СЛУЧАЙНОГО ПОДХОДА [c.240]

Все описанное выше в этой главе относилось к автоматическому секвенированию ДНК ферментативным методом по Сэнгеру. Что касается секвенирования путем химической деградации по Максаму-Гил- [c.329]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология