Автоматическое секвенирование полипептидов

Рис. 4.11. Образование фенилтиогидантоина из аминокислоты (или N-кoнцeвoгo остатка полипептида). Фенилизотиоцианат р>еагирует с аминогруппами аминокислот или пептидов с образованием фенилтиогидантоиновых производных. Последующая их обработка кислотой в растворителях, не содержащих гидроксильных Групп, приводит к циклизации производных с образованием фенилтиоги-дантоинов. Эта р>еакция, позволяющая идентифицировать N-кoнцeвoй остаток пептида, используется при автоматическом секвенировании полипептидов.

Расщепление полипептида на фрагменты, пригодные для автоматического секвенирования [c.38]

При автоматическом секвенировании (определении аминокислотной последовательности) используют крупные (30—100 остатков) пептиды. Однако многие денатурированные высокомолекулярные полипептиды оказыватся нерастворимыми. Это связано с тем, что гидрофобные остатки, ранее укрытые [c.35]

Приборы для автоматического секвенирования (секвенаторы) работают наиболее эффективно, когда длина полипептидов составляет 20 0 остатков. Эти требования в значительной мере способствовали разработке методов расщепления полипептидов на фрагменты нужного размера и их очистки. Основной задачей стало не получение большого числа малых фрагментов, пригодных для ручного секвенирования, а расщепление на малое число крупных фрагментов (от 30 до 100 остатков). При этом желательно было осуществить полное высокоспецифичное расщепление по ограниченному числу связей. Этим требованиям отвечает расщепление цианогенброми-дом (СЫВг), трипсином и о-иодозобензолом. [c.38]

Большое число работ, опубликованных в 1980—1983 гг., посвящено отработке обратнофазовой гидрофобной хроматографии фенил-тиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-АК). В виде таких производных аминокислоты одна за друго отщепляются при автоматическом определении последовательности аминокислот в полипептиде по методу Эдмана. Эта операция получила название секвенирования белков, а соответствующие автоматические приборы [c.196]

Этап 1 протекает быстро в слегка щелочной среде. Этап II можно вести в кислой безводной среде, а гидрофобное производное (АТ-АК) легко перевести в такой органический растворитель, в котором укороченный пептид выпадет в осадок. Таким образом, АТ-АК и пептид можно отделить друг от друга. Иеред началом второго цикла секвенирования этот осадок должен быть снова растворен. Этап III протекает относительно медленно, так что его имеет смысл проводить отдельно, вне прибора, автоматически выполняющего последовательные циклы присоединения ФИТЦ к постепенно укорачивающимся остаткам полипептида и отщепления одной за другой АТ-ироизвод-ных аминокислот, которые выводятся наружу в коллектор фракций. Дополнительной обработкой водным раствором кислоты АТ-АК преобразуют в ФТГ-АК. [c.511]

В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. автоматической процедуре последовательного отщепления и идентификации N-кoнцeвыx аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодирующего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов. Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным [c.38]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология