Автоматическое определение аминокислотной последовательности

Циклический характер этих реакпий дает возможность автоматизировать весь пропесс. В настояшее время выпускаются приборы (аминокислотные секвенаторы), производящие автоматическое определение последовательности аминокислот в пептидных фрагментах. На последнем этапе анализа последовательности аминокислот, полученные для пептидных фрагментов, располагают в том же порядке, как они были расположены в интактной цепи. Для этого сравнивают последовательности наборов перекрывающихся фрагментов, полученных при расщеплении одного и того же белка различными протеолитическими ферментами. [c.220]

В соответствии с термодинамической гипотезой Анфинсена и теорией структурной организации белка (см. гл. 2), будем считать, что механизм свертывания этих сложных олигопептидов является не статистическим, а статистико-детерминистическим, причем стерически возможными или предпочтительными становятся взаимодействия только между определенными парами остатков ys. Расчет всех молекул строился таким образом, что его результаты должны были опровергнуть или доказать справедливость представления о том, что определяет конформацию молекулы не образование дисульфидных мостиков, а, напротив, детерминированные состояния различных участков цепи, взаимодействия между которыми диктуют избирательную сближенность цистеиновых пар. При априорном многостадийном конформационном анализе пептидов из 18, 21, 22 и 36 аминокислотных остатков случайная сближенность цистеинов практически исключена. Поэтому автоматический приход на завершающей стадии расчета каждого пептида к самым низкоэнергетическим конформациям линейной последовательности молекулы с близкими контактами между соответствующими остатками ys будет одновременно свидетельствовать о наличии согласованности всех видов межостаточных взаимодействий в глобальной структуре (одно из основных положений конформационной теории белка), справедливости термодинамической гипотезы образования дисульфидных связей, адекватности использованных в расчете потенциальных функций реальным атом-атомным взаимодействиям и, наконец, [c.292]

Введение 33 Биомедицинское значение 33 Структура пептидов 33 Ионные формы пептидов 34 Конформация пептидов в растворе 35 Методы разделения пептидов 35 Определение аминокислотного состава пептидов 36 Определение первичной структуры полипептидов 37 Автоматическое определение аминокислотной последовательности полипептидов методом Эдмана 38 Автоматический синтез пептидов 40 Литература 41 [c.375]

Определение аминокислотной последова- Автоматический анализ аминокислотной последовательности белков тельности в белках [c.247]

На основе приведенной схемы расщепления под действием Ф. был разработан прибор для автоматического определения аминокислотной последовательности в белках и пептидах (41. [c.492]

Другой вариант автоматического определения аминокислотной последовательности коротких пептидов, основанный на ковалентном присоединении их к нерастворимому носителю, предложен Р. Ларсеном. Реакционным сосудом в твердофазном секвенаторе служит хроматографическая колонка, с носителем которой ковалентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускаются необходимые реагенты и растворители. Присоединение пептида к носителю является определяющей стадией в процессе. Для этой цели широко применяются матрицы на основе [c.63]

Хроматография производных аминокислот получила интенсивное развитие в связи с разработкой методов определения первичной структуры белков. Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматографическими методами анализа. Основное внимание было направлено на разработку методов определения N-концевых остатков аминокислот в белках, причем в идентификации соответствующих производных большое значение имели тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография (БХ) (см. обзоры [1, 2]). Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографий вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Понятия современный и классический метод используют здесь условно, поскольку новые методики обычно создают на базе стандартной аппаратуры примером может служить автоматический анализ ДНФ- и ДНС-аминокис-лот [3, 4]. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. По-видимому, всеобщее увлечение ДНФ-аминокислотами проходит окончательно, уступая место повышенному интересу [c.360]

Отщепление по Эдману при помощи ФИТЦ — наиболее распространенный и надежный метод определения аминокислотной последовательности пептидов и белков, В настоящее время в анализе и больших, и малых пептидов используют ручной и автоматический методы при этом в большинстве случаев идентификацию отщепленных аминокислот проводят в виде их ФТГ-производных. Анализу последних посвящено множество статей, В этой главе рассматривается пять основных методов анализа ФТГ-производных аминокислот. [c.405]

Ясно, что для проведения параллельных опытов нужно иметь либо несколько автоматических установок, что с финансовой точки зрения допустимо лишь для небольшого числа лабораторий, либо большой штат научных сотрудников. Однако во многих случаях возникает необходимость проведения большого числа анализов. Например, при исследовании структуры белка для определения полной аминокислотной последовательности белка со средним молекулярным весом требуется проделать около 3—4 тыс. анализов. [c.242]

При изучении небольших пептидов подходящим методом аминокислотного анализа, например с помощью автоматического аминокислотного анализатора, можно достаточно определенно установить состав пептида, лишенного своей концевой группы. Проследив за изменением аминокислотного состава на последовательных этапах деградации, можно восстановить аминокислотную последовательность изучаемого пептида. [c.283]

Одной из глобальных задач современной биологии и ее новейших разделов молекулярной биологии, биоорганической химии, физико-химической биологии—является выяснение молекулярных основ и тонких механизмов синтеза белка, содержащего сотни, а иногда и тысячи остатков L-амино-кислот. Последние располагаются, как это установлено, не хаотично, а в строго заданной последовательности, обеспечивая тем самым уникальность структуры синтезированной белковой молекулы, наделенной уникальной функцией. Другими словами, механизм синтеза должен обладать весьма тонкой и точной кодирующей системой, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Установлено, что кодирующая система однозначно определяет первичную структуру, в то время как вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются фи-зико-химическими свойствами и химической структурой радикалов аминокислот в полипептиде. [c.509]

Механизм гомотропного и гетеротропного взаимодействия в гемоглобине, по-видимому, зависит от трех типов конформационных переходов в белке небольших изменений третичной структуры каждой из полипептидной субъединиц, от малых изменений четвертичной структуры и больших изменений четвертичной структуры комплекса из четырех ассоциированных полипептидных субъединиц. Первый из этих переходов представляет собой последовательность изменений, охватывающих только небольшую область полипептида, и связывает процессы, в которых участвует железо, с равновесием между свободными и связанными аминокислотными остатками на определенном участке поверхности субъединицы. Этот тип переходов достаточен для объяснения гетеротропного взаимодействия в белках, состоящих только из одной полипептидной цепи. Однако в гемоглобине конформационные изменения второго типа приводят к образованию или разрыву солевых мостиков между субъединицами, что автоматически влечет за собой небольшие изменения четвертичной структуры. Нарастание этих небольших изменений в четвертичной структуре в конце концов приводит к К—Т-переходу. Таким образом, процессы, в которых участвует железо в каждой из субъединиц, косвенно связаны с переходами между К- и Т-формами всего белка. [c.182]

При этом анализу подвергают отщепляющуюся аминокислоту или непосредственно ее фенилтиогидантоин. Указанный принцип положен в основу работы секвенсоров, автоматически определяюш их аминокислотную последовательность в пептидных фрагментах, получаемых ферментативным расщеплением исследуемых белков. По Сэнджеру концевую аминогруппу П. маркируют 1-фтор-2,4-динитробензолом, подвергают П. гидролизу и определяют динитрофенильные производные аминокислот. С-Концевую аминокислоту можно отщепить с помощью карбоксипептидазы. Используют также полный гидразиполиз пептида. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, выделяются в виде гидразидов. Применяют также масс-спектрометрич. определение аминокислотной последовательности в П. Сведения об оптич. чистоте П. могут быть получены исследованием их атакуемости природными ферментами. [c.15]

Многие стадии, через которые проходит определение аминокислотной последовательности длийбых полипептидных цепей, и одновременная регистрация всех полученных результатов осуществляются в настоящее время автоматическими аминокислотными анализаторами с программным управлением. Даже расщепление по Эдману проводится при помощи специального прибора с программным [c.154]

Второй важный вьшод заключается в том, что вторичная структура полипептидов, в частности а-спираль и Р-конформация, возникает самопроизвольно и автоматически вследствие того, что данный полипептид имеет определенный амщю-кислотный состав и определенную аминокислотную последовательность. Характерная вторичная структура белка-это его наиболее устойчивая форма при заданных биологических условиях. а-Спираль и р-структура стабилизируются множеством водородных связей-внутрицепочечных в случае а-спирали и межцепочечных в случае Р-структуры. Хотя водородные связи, взятые в отдельности, относительно слабы, все вместе они придают а-спирали и Р-структуре значительную устойчивость. [c.181]

Таким образом Сэнгер показал, что инсулин состоит из двух полипептидных цепей, каждая из которых обладает вполне определенной последовательностью аминокислотных остатков. Методы, разработанные Сэпгером, были затем использованы для определения первичной структуры более длинных полипептидных цепей, и в частности для анализа ферментных белков. С тех пор было введено много технических усовершенствований, а со временем для определения аминокислотных последовательностей стали использовать и автоматическое оборудование. Тем не менее анализ полной аминокислотной последовательности ферментного белка, содержащего сотни аминокислот, все еще остается страшно трудным делом, требующим три или четыре человеко-года тяжелой работы. А-белок триптофан-синтазы В. соН, первичная структура которого показана на фиг. 43, является одной из самых длинных полипептидных цепей с известной аминокислотной последовательностью. [c.90]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Впечатляющие успехи, достигнутые в последние десятилетия в определении первичной структуры белков, стали возможны благодаря, во-первых, введению в практику метода последовательного отщепления аминокислот от пептидов и белков при помощи фенилизотиоцианата (ФИТЦ) [14] и, во-вторых, разработке автоматического варианта этого метода [15]. Фенилизотиоционат до снх пор сохранил свое значение для определения аминокислотной последовательности белков. Во многих лабораториях все еще пользуются ручными вариантами определения последовательности (например, методика, объединяющая отщепление по Эдману с идентификацией ДНС-аминокислот [19], полуавтоматический вариант определения с использованием ФИТЦ или недавно разработанный метод, основанный на совместном использовании 4-N,N -димeтилaминoaзoбeнзoл-4"-изотиоцианата (ДАБИТЦ) и ФИТЦ [58]. Ручные модификации метода применяются по следующим причинам [c.374]

При автоматическом секвенировании (определении аминокислотной последовательности) используют крупные (30—100 остатков) пептиды. Однако многие денатурированные высокомолекулярные полипептиды оказыватся нерастворимыми. Это связано с тем, что гидрофобные остатки, ранее укрытые [c.35]

К середине 1940-х годов пептидная теория белков Фишера и Вальд-шмидт-Лейтца была почти повсеместно принята. Встал вопрос о точном знании деталей химического строения, т.е. о конкретном порядке расположения аминокислот в белковых цепях. Впервые такое сложное исследование удалось провести в течение десятилетия (1945-1954 гг.) ф. Сенгеру, определившему аминокислотную последовательность инсулина. Вторым белком была рибонуклеаза А. Полная структура этого фермента расшифрована С. Муром, К. Хирсом и У. Стейном (1960 г.). Вскоре идентификация химичекого строения белков стала производиться с помощью автоматических секвенаторов и приобрела рутинный характер. Однако достижения в решении первой фундаментальной задачи проблемы белка не принесли удовлетворения. Сначала не вызывало сомнений, что химические и физические свойства белков получат свое объяснение, как только станет известно химическое строение их молекул. Однако основанная на опыте всей органической химии и биохимии надежда на то, что установление химического типа и строения молекул окажется достаточным для понимания хотя бы в общих чертах их специфического функционирования, не оправдалась. Тем самым определение структуры из конечной цели исследования превратилось в необходимый для последующего изучения белков начальный этап. Утвердилась мысль, что химическая универсальность и практически необозримое многообразие свойств соединений этого класса при строгой специфичности его отдельных представителей связаны с особенностями пространственных структур белковых молекул. [c.67]

Определение последовательности аминокислотных остатков в пептидах (Ледерер М. М. Шемякин и Н. С. Вульфсон). Благодаря широкому применению автоматических аминокислотных анализаторов определение аминокислотного состава пептидов не представляет в настоящее время значительных трудностей. Однако один из важнейших вопросов установления первичной структуры белков и пептидов — определение последовательности аминокислотных остатков в цепи продолжает оставаться весьма трудоемким и сложным. Недавно было установлено, что при масс-спектрометрировании эфиров Н-ацилированных олигопептидов в качестве первого акта фрагментации молекулярного иона происходит элиминация алкоксильной грушты и возникает линейный ион, у которого положительный заряд локализован на С-конце, а N кoнeд защищен ацильным остатком. Дальнейший распад этого иона заключается в последовательной элиминации аминокислотных остатков с перемещением положительного заряда вдоль цепи. Например, фрагментация [c.591]

Биохимия является в основном экспериментальной наукой. Она опирается на арсенал методов, созданных неорганической, органической, аналитической и физической химией. Однако многие из задач, с которыми сталкиваются биохимики, вследствие специфики изучаемых объектов требуют нетрадиционных подходов. В первую очередь это касается изучения биополимеров. Например, химический синтез белков представляет собой повторение десятки или даже сотни раз реакции образования пептидной связи с целью последовательного присоединения на каждой стадии к растущей полимерной цепи определенного аминокислотного остатка. Образование пептидных связей прекрасно отработано и с точки зрения классической органической химии не представляет ни трудности, ни интереса. Но необходимость проводить последовательно множество таких превращений без существенного уменьшения выхода, без повреждения уже созданной на предыдущих этапах синтеза полипептидной цепи ставит свои специфические проблемы, которые решаются оригинальными, разработанными именно для таких задач приемами. Венцом этих приемов является автоматический твердофазный синтез полипептидов. Столь же не традиционно выглядит задача устанобления химического строения биополимеров. Структуры отдельных мономерных звеньев как белков, так и нуклеиновых кислот давно установлены с использованием классических методов органической химии, и задача сводится к тому, чтобы для каждого конкретного биополимера определить, в каком порядке в изучаемой полимерной цепи располагаются разнотипные мономерные звенья. [c.10]

Установление стрзтстуры природных белков подразумевает, в первую очередь, установление первичной структуры, то есть аминокислотной последовательности В настоящее время существуют надежные способы ее определения, в том числе с помощью автоматического аминокислотного анализатора (С Мур, У Стейн, 1958, Нобелевская премия 1972 г ) [c.881]

Можно предвидеть значительное улучшение химических и биохимических методов определения последовательностей оснований в нуклеиновых кислотах и аминокислотных последовательностей в белках. Сейчас газофазный секвенатор, работающий в автоматическом режиме, позволяет надежно определять до 60 последовательно расположенных аминокислот (называемых аминокислотными остатками), расположенных с аминоконца белка. Применение тандемной масс-спектрометрии или других новых методов позволяет устанавливать в автоматическом режиме полные аминокислотные последовательности белков, содержащих несколько сот аминокислотных остатков. [c.180]

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе-секвенаторе (от англ. sequen e - последовательность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50-60 аминокислотных остатков. [c.54]

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), использованный Эдманом и Бэггом и описанный в их классической работе, посвященной автоматическому секвенатору [2], наиболее прост в экспериментальном отношении, не требует дорогого оборудования, но характеризуется невысокой чувствительностью (- 1 нмоль), тех удобна как для ручного, так и для автоматического определения последовательности однако это скорее качественный, чем количественный метод. Как бесспорное достоинство метода надо отметить возможность одновременного анализа нескольких образцов. Метод можно сделать полуколичественным, элюируя ФТГ с хроматографической пластинки, но обычно это не делается. При идентификации ФТГ-Arg и ФТГ-Н з ТСХ следует дополнять другими методами — ВЭЖХ тех же ФТГ-аминокислот, или аминокислотным анализом свободных аминокислот, полученных при обратном гидролизе ФТГ-аминокислот. Следует проводить обратный гидролиз при анализе только коротких пептидов и высокоэффективном определении последовательности аминокислот средних пептидов на секвенаторе с использованием наномольных количеств образца. Для анализа ФТГ-производных аминокислот с середины 60-х годов стала использоваться газожидкостная хроматография (ГЖХ). Этим методом можно быстро и количественно определить большинство, но не все с "ГГ-производные аминокислот. В неспособности ГЖХ обеспечить однозначную идентификацию ФТГ-производных всех 20 аминокислот заклю- [c.405]

В этой главе рассматриваются некоторые методики, используемые в настоящее время в автоматическом ЖФ-анализе аминокислотной последовательности пептидов и белков. Рассматриваются правила эксплуатации прибора, методы подготовки образца и способы контроля состояния прибора. Помимо этого, обсуждаются вопросы использования 1юсителей и основные проблемы автоматического определения последовательности. Опубликованы обширные обзоры по каждому из упомянутых вопросов [10, 14, 16]. [c.425]

Более общий подход Левитта и Варшела допускает упрощенное представление не только спиральной, но и других конформаций. Предложенный алгоритм был запрограммирован для ЭВМ, что, однако, не делает метод свободным от ряда серьезных недостатков. Так, в основной цепи белка отсутствовала пептидная группа атомов СО-ЫН, Са-углеродные атомы соединялись виртуальной связью, а боковые цепи заменялись укрупненными атомами (большими искусственными атомами, заменяющими целые атомные группировки). Эта модель была впервые применена к небольшому белку — панкреатическому трипсиновому ингибитору [33], В работе [33] был достигнут определенный успех, который с позиций сегодняшнего дня имеет в основном историческое значение. Следует отме-тить, что это исследование получило высокую оценку и вызвало оживленную дискуссию [14, 44]. Благодаря широкому обсуждению были выработаны общие подходы, применяемые при предсказа1ши структуры белка, согласно которым любая соответствующая процедура должна 1) быть полностью автоматической 2) иметь входные параметры, применимые к любым белкам 3) быть количественно воспроизводимой и 4) быть свободной от неоправданных приспособлений к конкретным объектам. Кроме того, единственной переменной входной информацией о белке должна служить его аминокислотная последовательность. Впоследствии именно Левитт внес большой вклад в развитие методов предсказания третичной структуры белков. [c.596]

Для установления точной последовательности аминокислот четыре больших пептидных фрагмента, полученных из окисленной рибонуклеазы при гидролизе ее трипсином, подвергались гидролизу с химотрипсином [78]. Миллиграммовые количества были выделены и освобождены от солей для уменьшения потерь при последующем анализе. Эти пептиды были исследованы всеми доступными методами белковой химии (автоматический аминокислотный анализ [162], ступенчатое расщепление фенилизотиоцианатом [50, 156, 157], динитрофенилирование и определение К-концевых аминогрупп [57, 77], гидролиз концевых групп карбоксипептидазой [57] и лейцинаминопептидазой [161]). [c.415]

Новый способ программирования реализован в аминокислотном анализаторе фирмы "Te hni on", модель TSM, предназначенном для последовательного анализа большого количества проб. В этом приборе для автоматического ионообменного разделения и последующего аналитического определения фактически используется принцип Автоанализатора. Анализатор управляется программируемым перистальтическим затвором, действующим подобно кулачковому затвору Автоанализатора. Принцип работы перистальтического затвора иллюстрируется рис. 9.2. [c.291]

В связи с тем, что существуют группы белков с преимущественным содержанием а-спиралей и -структур, можно изучать их пространственную организацию, или вовсе не предсказывая конформационных состояний отдельных остатков, что не удается делать правильно, а беря вторичные структуры прямо из опыта, или оценивая брутто содержание последних с помощью известных статистических методов, что автоматически увеличивает точность предсказания на несколько десятков процентов, поскольку в этом случае приходится идентифицировать состояния не 20 аминокислотных остатков, а лишь трех-четырех структурных групп Левитта и Чотиа. При изменении постановки задачи и неизбежном снижении требований к ожидаемой информации появляется возможность решения других вопросов, правда, менее важных. Например, можно сфокусировать внимание на определении общего процентного содержания аминокислотных остатков в последовательности, находящихся в а- и -областях, и полученные результаты сравнивать с аналогичными данными спектральных методов. Можно поставить вопрос о том, каков порядок взаимодействий вторичных структур друг с другом и какие в принципе возможны способы укладки а-спиралей относительно -структур и последних друг относительно друга, и о частоте их встречаемости в белках. Можно, наконец, разрабатывать новые предсказательные алгоритмы, классифицирующие белки по группам (а), ( ), (а + ) и (a/ ). Подобные вопросы, до работы Левитта и Чотиа, представлялись частными случаями. Теперь же анализ укладки, например, полипептидной цепи апомиоглобина — это уже исследование белка, не случайно взятого из множества других, а планомер-316 [c.316]

В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. автоматической процедуре последовательного отщепления и идентификации N-кoнцeвыx аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодирующего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов. Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным [c.38]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология