Метод Эдмана

Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии СРзСООН отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. Далее этот процесс повторяется вновь [c.94]

Так как метод Эдмана позволяет проанализировать полипептидные [c.95]

Для этой цели в настоящее время можно было бы воспользоваться методом Эдмана—последовательным отщеплением аминокислот в виде фенилтиогидантоинов (см. стр. 511). Широко применяют также кар-боксипептидазу и аминопептидазу. [c.514]

Достаточно выделить Ser-Tyr, Ser-Met, Glu-His и Phe-Arg после первой деградации и Tyr-Ser, Met-Glu и His-Phe после второй, чтобы дать полную последовательность первых восьми остатков. В случае устойчивой к гидролизу связи необходимо отщепить один или два остатка по методу Эдмана с тем, чтобы получить продукт, необходимый для последующего ферментативного гидролиза. [c.272]

Для определения аминокислотной последовательности рибосомальный белок L32 был расщеплен на фрагменты двумя различными методами (А, Б) и для полученных фрагментов методом Эдмана была определена первичная структура. Для метода, А получены 12 фрагментов [c.337]

Разработаны химические методы специфического расщепления пептидных связей и по остаткам других аминокислот, однако они не нащли столь широкого применения. В настоящее время, когда по методу Эдмана можно анализировать крупные белковые фрагменты, наиболее целесообразными представляются методы расщепления по относительно редко встречающимся аминокислотным остаткам, таким как Тгр и Met. [c.273]

Совершенно ясно, что требованиями, предъявляемыми к любому методу ступенчатого отщепления концевых групп, являются высокий выход продукта отщепления на каждой стадии и отсутствие одновременного расщепления других пептидных связей. Рассмотрение наиболее удачного метода отщепления концевых групп — метода Эдмана — приводит к выводу, что оптимальные условия расщепления еще оконча- [c.238]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Преимущество метода Эдмана состоит в том, что при отщеп-1ИИ каждой концевой а-аминокислоты остальная часть пептид-й молекулы не разрушается и операции по отщеплению можно вторять. [c.349]

Другими вариантами ступенчатой деградации являются комбинация метода Эдмана с дансильным методом [108 — 110], микроопределение на фильтровальной бумаге, тонкослойная хроматография на полиамидных слоих и конденсации с пентафторфенилизотиоцианатом. В противополож-носты-фенилизотиоцианату фторпроизводное допускает применение при газохроматографическом определении тиогидантоинов детектора с электронным захватом [111]. [c.370]

Ф. Сэнгер впервые полностью расшифровал первичную структуру белкового гормона инсулина, используя метод Эдмана. [c.42]

Модификацией метода Эдмана является применение метилизотиоцианата вместо фенилизотиоцнаната. При этом Н-концевая аминокислота отщепляется в виде метил-тиогидантоина (В. М. Степанов, В. Ф. Кривцов, 1963). Дальнейшее весьма перспективное развитие метода Эдмана состоит в совмещении его с масс-спектрометрической идентификацией отщепляемых от пептида Н-концевых аминокислот в виде фенил- или ме-тилтиогидантоинов (Н. С. Вульфсон, В. М. Степанов, В. А. Пучков, А. М. Зякун 1963. 1964).— Прим. ред. [c.691]

В настоящее время в связи с истощением запасов высококачественных лиролюзитовых руд появилась потребность в заменителе. Таким заменителем стал искусственны диоксид марганца, который получают из рядовых марганцевых руд. Подавляющее большинство искусственного диоксида марганца получают электрохимическим методом (ЭДМ), химический диоксид марганца (ХДМ) осаждается при ззаимодействии раствора соли двухвалентного марганца с сильными окислителями — перхлоратом, перманганатом. [c.204]

Большое число работ, опубликованных в 1980—1983 гг., посвящено отработке обратнофазовой гидрофобной хроматографии фенил-тиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-АК). В виде таких производных аминокислоты одна за друго отщепляются при автоматическом определении последовательности аминокислот в полипептиде по методу Эдмана. Эта операция получила название секвенирования белков, а соответствующие автоматические приборы [c.196]

Двумерная и одномерная распределительная ТСХ на целлюлозных, силикагелевых и полиамидных иластинках аминокислот, их данзилированных, динитрофенильных и фенилтногидантоиновых производных (ФТГ-АК) последнее — как основной или контрольный метод идентификации аминокислот при секвенировании белков по методу Эдмана. [c.460]

Используя аналогичную систему ТСХ для идентификации ФТГ-АК в последовательных циклах секвенирования полипептидов по методу Эдмана (вручную), Рид и Мак-Кэй столкнулись со следующей трудностью иа месте ФТГ-Arg в каждом цикле выходил некий, также гасящий флюоресценцию фона побочный продукт реакции. Они описали метод детектирования истинного пятна ФТГ-Arg путем дополнительной обработки пластинки смесью (1 1) 0,02%-ного раствора фенантренхинона и 10%-ного раствора NaOH в 60%-ном этаноле. После такой обработки только пятна ФТГ-АК прн освещении длинноволновым УФ-светом давали интенсивную желто-зеленую флюоресценцию иа слегка флюоресцирующем голубоватом фоне пластинки [Reed, Ma Kay, 1978]. [c.485]

Для непосредственного анализа первичной структуры Б. обычно используют сек вен а тор-прибор, к-рый с высокой эффективностью осуществляет последовательное авто-матнч. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все р-ции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4). Образец Б. распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакцин до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора-Б. и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков для таких соединений обычно удается определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) [c.252]

В случае применения безводных органических растворителей, содержащих кислоту, возможна миграция ацильных групп, находящихся у определенных остатков оксиаминокислот. Так, при определении концевых групп по методу Эдмана (см. стр. 237—245), согласно которому производное пептида обрабатывают нитрометаном и НС1 [87], уксусной кислотой й НС1 [88] или диоксаном и НС1 [186] для циклизации Ы-Конце-вого остатка, установлено [2, 314], что на последующих стадиях отщепления обнаруживаются небольшие Количества Ы-концевь1Х остатков серина или треонина. В одном случае это привело к неправильному выводу о последовательности аминокислотных остатков [2, 186]. Обычно исследуемое соединение обрабатывают СвНаЫСЗ или динитрофторбензолом при pH 8,5. Если же белок находится в среде с такой величиной pH до добавления реагента, то свободные аминогруппы, появляющиеся в результате миграции ацильной группы от N к О, вновь образуют пептидные связи. Предварительную [c.222]

Реагенты, используемые для этой реакции, указаны в табл. 5. Все эти реагенты в мягких условиях (pH 8,5, низкая температура) образуют производные, отличающиеся друг от Но скорости циклизации и растворимости в кислотных рёагёйтах, вызывающих циклизацию. Указанные реагенты успеШНо рйменялись для исследования простых пептидов, но только ф йлизотиоцианатный метод Эдмана нашел широкое [c.239]

Тиогидантойны удается идентифицировать хроматографированием на бумаге [68, 94] или путем регенерации из них аминокислоты [19], как это описано выше для фенилтиогидантоинов, полученных по методу Эдмана (см. стр. 237—245). [c.247]

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе-секвенаторе (от англ. sequen e - последовательность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50-60 аминокислотных остатков. [c.54]

Значение метода Эдмана последовательной деградации пептидов и белков существенно возросло с развитием приборов [18], позволяющих автоматически проводить различные стадии обра- [c.266]

Независимо от того, какая модификация метода Эдмана используется, после каждого цикла необходимо собирать производные 2-анилинотиазолона-5 Л -концевых аминокислот и превращать их в 2-тио-З-фенилгидантоины (12) нагреванием с трифторуксусной кислотой. Известно несколь <о методов [23] идентификации 2-тио-гидантоинов. До того, как были разработаны удобные способы отделения 2-тиогидантоинов, широко использовали их гидролиз до аминокислот, так как для идентификации и количественного определения можно использовать аминокислотный анализатор. При гидролизе, однако, неизбежно разрушаются некоторые гидантоины (например, гидантоинозые производные серина и треонина), и в настоящее врем предпочитают методы прямого их определения. [c.270]

Получающиеся дипептиды можно разделить с помощью ионообменной хроматографии подобно тому, как это делают при аминокислотном анализе, одиако при поточном расщеплении необходимо собирать фракции для дальнейшего анализа. Другой набор дипептидов можно получить, если перед обработкой дипептидиламино-пептидазой провести удаление iV-концевого остатка по методу Эдмана (один цикл). Так, если удалить iV-концевой Ser в -кортико-тропине, то должны образоваться другие дипептиды схема (21) . [c.272]

Хотя описан ряд методов селективного расщепления определенных пептидных связей белковой цепи на такие фрагменты, которые можно анализировать по методу Эдмана, щирокое использование нащли всего несколько из них. Наиболее популярным методом является использование бромциана для расщепления пептидных связей по остаткам метионина схема (22) . Остаток метионина превращается в гомосерин и его лактон, которые становятся С-концевыми остатками всех фрагментов, за исключением С-концевого фрагмента исходного белка. Так как Met встречается относительно редко, фрагменты, получающиеся после подобного расщепления, довольно крупны, но с помощью современных вариантов анализа по Эдману можно проводить анализ их последовательности. Более того, лактон гомосерина на С-конце является подходящим участком для ковалентного связывания таких фрагментов с нерастворимым носителем при твердофазном секвентном анализе см. схему (17) . [c.273]

Хорошо известный метод Эдмана для определения аминокислотной последовательности в пептидах основан на образовании тиогидантоинов (12) за счет концевой аминокислоты при действии на пептиды соответствующего RN = = S. Масс-спектры таких тиогидантоинов достаточно характеристичны и облегчают задачу идентификации отщепленной аминокислоты [507]. Масс-спектры фенилтиогидантоинов (12, R = 6Hs), например, всегда содержат интенсивные пики М+ и пики ионов [СбН5]+ и [ eH5N = = S] + - (m/z 135). Если в (12) К >СНз, то из М+ легко отщепляется молекула (R —Н). [c.291]

Д. АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ МЕТОДОМ ЭДМАНА В ДАНСИЛЬНОМ ВАРИАНТЕ [7—9] [c.284]

После удаления N-кoнцeвoй аминокислоты пептида, анализируемого по методу Эдмана, N-кoнeц оставшейся полипептидной цепи можно определить дансильным методом. На следующем этапе отщепляют новую концевую аминокислоту и снова определяют N-конец остатка. Благодаря очень высокой чувствительности дан-сильного метода при наличии 0,1 мкмоля пептида можно с достаточной достоверностью идентифицировать 10—15 аминокислот. [c.284]

При работе методом Эдмана очень важно тщательно высушивать препарат, а также полностью удалять трифторуксусную кислоту, поскольку следы кислоты мешают нейтрализовать раствор и обеспечить оптимальную величину pH. Это ведет к мгновенному гидролизу ДНС-С1, который не успевает прореагировать са-ЫНг-груп-пами. Если после гидролиза выявляется лишь ДНС-ОН, то данси-лирование следует повторить, особенно внимательно контролируя pH. На закисление среды указывает выделение пузырьков газа если оно происходит, следует сразу же проверить pH и в случае необходимости нейтрализовать раствор, добавив бикарбонат. [c.285]

Метод Эдмана заключается во взаимодействии М-концевой 1МИН0КИСЛ0ТЫ с фенилизотиоцианатом в щелочной среде. При 1ьнейшей обработке слабой кислотой без нагревания проис-гит отщепление от цепи меченой концевой ФТГ-аминокис-гы (см. 11.1.4). ФТГ-аминокислота идентифицируется мерами тонкослойной или газожидкостной хроматографии л. 15.1). [c.349]

Из трех возможных разбиений нуклеотидной последовательности на кодоны выбрать правильное часто удается по наличию при этом разбиении открытой рамки считывания — последовательности кодонов, среди которых на большом протяжении не встречается кодонов-терминаторов. Для случайной последовательности вероятность появления в определенном месте кодона-терминатора достаточно велика — 3/64, или около 0,05. Для определения положения первого кодона, участвующего в программировании полипептидной цепи, мойсно определить в исследуемом белке методом Эдмана несколько аминокислотных остатков с N-конца и затем найти на полинуклеотиде адекватную последовательность кодонов. В случае наличия или подозрений о наличии интронов лучше всего иметь дело не с геном, а с ДНК, комплементарной зрелой информационной РНК, в которой в результате сплайсинга участки, соответствующие интронам и поэтому не принимающие участия в кодировании,полипептидной цепи, отсутствуют. Такую комплементарную ДНК можно получить с помощью так называемой обратной транскрипции — матричного синтеза ДНК по информации, содержащейся в мРНК с помощью ферментов обратной транскрипций, содержащихся в некоторых вызывающих опухоли вирусах, например в вирусе птичьего миелобластоза. [c.174]

Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградаций дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически в ручном варианте метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередую-пщхся процедур добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде, пригодном длЯ следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций — автоматические секвенатори полипептидов. С их помсоцью удается провести до 40 — 60 шагов ступенчатой деградации. [c.271]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Имеется ряд методов, с помощью которых можно определять как N-концевой аминокислотный остаток, так и N-концевую аминокислотную последовательность. К ним относятся деградация по методу Эдмана и ферме ггативный гидролиз аминопептида-зами. Эти методы будут подробно рассмотрены в разделе, посвященном определению аминокислотной последовательности пептидов. [c.38]

Существенным недостатком метода является то, что полученные прн расщеплении фрагменты, за исключением N Koнцeвoгo, не содержат свободной а-амино-группы и поэтому не могут подвергаться деградации по методу Эдмана. С помощью восстановительного десульфирования на никелевом катализаторе удается превращать иминотиазолидинкарбоновую кислоту в аланин. Однако при этом наблюдается частичное расщепление некоторых пептидных свизей. [c.52]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология